高通量质早期药物筛选和生物标志物检测
大规模筛选(高温超导),或大型的快速筛选化合物库对生物活动的目标,是一个很大的药物发现过程的一部分,特别是在早期阶段。有数百万可能成为一种新药的化合物,这些化合物筛选确定几最高的潜力——被称为药物先导物——可能需要数月时间,如果不是因为当前高温超导技术。这些先进的技术允许制药研究人员加快药物筛选过程的早期,发现导致减少所花费的时间,以便有更多的时间和精力给优化这些领导的有效性和安全性。
迅速地进行大量的化学测试不是一个战略有限的药物发现;研究人员把它应用在许多不同的生物和化学领域。另一个例子是生物标志物的检测。在本文中,我们探索两个新颖的高通量分析方法基于液相色谱-光谱法(质)的分析,可以增强早期药物筛选和生物标志物检测在诊所。
质快速屏幕药物绑定
“质谱筛选方法的伟大之处是,他们可以直接检测化合物的质量,所以他们比其他方法更可靠,只允许间接检测,”说希瑟教授Desaire、化学系、堪萨斯大学,堪萨斯州,美国。“例如,大多数光谱技术利用光来确定化合物有间接检测计划,有时干扰的结果。”
此外,质谱方法快速、选择性、高度敏感的(只需要少量的化合物),并可以检测多个化合物。但问题在于虚假击中或错过的发生,Desaire告诉我们。“当这些化验女士是用来识别潜在的铅化合物为目标蛋白,它们都为一个假阳性和假阴性率高,从而导致重大问题在后期的药物开发周期。”
找到解决这个问题的方法,Desaire和她的学生决定开发一个新的质谱测定铅化合物探针。他们的方法是集中在检测一个记者化合物电离,检测铅本身,而是这可能不是电离(1)。这种方法,研究人员不要忽视任何潜在的领导,不是得,导致假阴性——常见问题之一使用高温超导的质谱,根据Desaire博士Kasun Imaduwage,论文的主要作者详细的新方法。
审讯技术减少假阴性
Desaire和Imaduwage新技术严重依赖一个“记者”分子——一个已知的,得弱粘结剂允许绑定事件感兴趣的目标来衡量。记者首先是孵化与固定的目标蛋白质。一旦洗掉多余的记者,介绍了reporter-target复杂一批库化合物。如果库包含一个领导,比记者更强的粘结剂,它争夺相同的结合位点的蛋白质和取代复杂的记者。质用于检测和测量取代记者分子,离心后。
当一个高亲和性粘结剂取代记者,记者在检测信号增加,而控制样品。以这种方式(图1),一个绑定事件是可以衡量的,即使高亲和性配体不被女士”这是一个审讯技术,我们正在调查一批强大的粘结剂在图书馆的存在只通过检测报道分子,“Imaduwage说。
图1所示。实验工作流程Desaire和Imaduwage小说高通量质筛选方法。(来源:Sci Imaduwage et al。众议员2017)。
这种方法的一个挑战是低亲和配体的识别与平衡离解常数(Kd在微摩尔的范围。变得特别困难的,当靶蛋白的数量是有限的。另一个挑战是与固定目标。“对我们的分析,这是非常重要的固定靶蛋白以分离的化合物与protein-ligand复杂,“Imaduwage解释道。“然而,固定需要几个小时和带来许多弊端。自动试验装置,不需要固定目标将是一个有前途的方法来开发一个超高度大规模筛查试验。“Desaire集团认为,使用先进的膜过滤器可能会解决这个问题。
“最有趣的结果是确定一个新的碳酸酐酶(CA)抑制剂,pifthrin-µ,“Imaduwage说。“这是一个重要的结果,考虑到CA抑制剂的疾病的药物治疗是有价值的。”他走到解释pifthrin-µ不能检测到其他高温超导化验使用电子喷雾电离质谱(质),因为它不是得。“这是可能的原因pifthrin -µ仍然在雷达下,可以这么说。它还没有被确认直到现在CA抑制剂,即使其他科学家有超过100000种化合物筛选MS-based高温超导化验,通过使用CA作为目标蛋白质。”
最后,Desaire强调时间的决定因素并不总是确定高温超导的好方法,尤其是在当前的可用性不同的样品制备和分离技术。“一个有效的高温超导实验应该与不同种类的化合物。它应该会更快,因为不同的化合物是化验在同一运行/批处理,而不是在重复运行。”
因此,选择一个分析符合所有这些因素是至关重要的,正如Desaire说,它完全依赖于研究者决定适当的技术需求的基础上所需的实验。
高通量方法监控酒精滥用
有几种不同的生物标志物,临床医生在病人使用检测酒精滥用和phosphatidylethanol (PEth)高(2)。自2006年引入到诊所,PEth被用来跟踪饮酒容易因为高临床特异性和敏感性,和长窗检测。“PEth临床特异性和敏感性高于常用酒精CDT或gamma-GT等标记;特异性在理论上是100%,因为它是一个乙醇代谢产物,”说伊萨克松副教授安德斯,临床化学和药理学,瑞典隆德大学。可以用于医学诊断、随访和治疗评估酒精使用障碍”(图2)。
图2。在正常情况下,磷脂酶D(骑士)水解磷脂酰胆碱(PC)到phosphatidate和胆碱,但在乙醇的存在,骑士催化transphosphatidylation PC到相应phosphatidylethanol PEth同族体。(来源:伊萨克松et al, JALM协会的2018年)。
伊萨克松指出,在过去的几年里,样本的数量发送到他的实验室测试PEth稳步上升,促使他开发一种高通量分析屏幕也有成本效益的和可靠的。“我们需要一个与更高的吞吐量分析方法和分析/临床敏感性比我们先前的高效液相色谱法是基于一个蒸发光散射检测,”他解释道。“由于大量的样品和体力劳动,我们想创建一个示例检查可以使机器人化”。
法甲的团队能够想出一个液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)方法确定的存在PEth在3分钟,去年发表的(3),在开发过程中,面临的挑战是将样品检查(包括蛋白质沉淀/萃取步骤)一个自动化的过程有足够的分析灵敏度和选择性。隆德大学的研究人员成功地在他们的努力和证明,他们的方法是适合大规模临床实验室接收> 50000份临床样本/年。
“我们的方法使用一个自动化的样品检查只有一些小的人工干预,并且它是健壮的和高能力。外部质量样品显示标准差< 2 SD方法对所有的样本,自2013年开始的控制程序,法甲兴奋地说。不过,他补充称,标准化的方法是不完整的,因为它需要访问认证的参考材料,目前不可用。
引用
1。Imaduwage k p;Lakbub, j .;去,e . p .;Desaire, H。,质为基础的高通量快速筛选方法,提供没有假阳性或假阴性,识别新的碳酸酐酶抑制剂。2017年科学报告,7 (1),10324。
2。祝,g;Boscolo-Berto r;Cecchetto g;做,p;Nalesso, a;费拉拉,s d Phosphatidylethanol慢性酒精在血液标记使用:系统回顾和荟萃分析。分子科学国际期刊2012,13 (11),14788 - 14812。
3所示。法甲,a;沃尔特,l;汉森,t;安德森,a;联络小巷,j .;Blomgren, a高通量质/ MS法测定酒精使用生物标志物在临床样本Phosphatidylethanol通过使用一个简单的自动提取Procedure-Preanalytical和分析条件。2018年应用实验医学杂志,2 (6)880 - 892。
