大规模筛选药物发现的方法

药物研发是一个漫长而昂贵的过程。一个研究报道美国医学协会杂志》上发现在2009年至2018年之间,平均投资所需的药物,使其通过发展管道这可能被视为对监管部门的批准13亿美元。巨大的支出的一个原因是药物失败率高。研究发表在自然生物技术显示,2003年到2011年之间,90%的药物临床试验未能获得了美国食品和药物管理局(FDA)的批准。多年来,制药行业已经经历研发生产力的下降进而恶化未满足临床需求。在本文中,我们将讨论如何使用不同的大规模筛选(高温超导)方法可以帮助加速药物发现过程。

由于大量的可能的化合物可用于筛选,制药公司已经采用高温超导可以屏幕上它们的化学库的方法快速和廉价地识别最有前途的化合物与活动对特定生物的目标。高温超导通常涉及到的使用自动化(例如,液体处理机器人),小型化如1536孔板格式和大规模数据分析公司等人工智能。

“高温超导的药物发现行业几十年了。它允许自动分析毒品活动非常专门定制的生化指标。然而,到目前为止,这些故意设计的读数化验一直局限于一个很小的目标,”说朝阳你们博士他们开发了一个具有成本效益的RNA序列高温超导的协议。

在下面几节中,使用新开发的高温超导平台支持药物发现将突出显示。

荧光读出通过成像

荧光技术分析是一种方便的方法来可视化生物反应特定的化合物在高通量环境。基于荧光强度,生物活性的程度也可以确定。荧光化验可以这样发出信号或淬火生产或消除目标分子。最近,塞西莉亚Eydoux的研究工程师AFMB实验室,和他的同事们创建高温超导测定荧光技术的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(冠)RNA合成复杂。这个复杂的是由的蛋白质non-structural-protein (nsp) 7, nsp8 nsp12和由于SARS-CoV-2被高度同源,它有可能被利用来设计蛋白质合成抑制剂。利用已知的蛋白质相互作用,研究小组创建了一个试验时在nsp-7/8协会nsp-12 (RNA依赖的RNA聚合酶),荧光染料会插入双链RNA产生荧光信号。

研究人员对1520年fda批准的验证试验,筛选化合物的专机化学库^®。这种化合物库被选为其较高的化学和药理多样性和已知的生物利用度和人类的安全。筛选的帮助下进行自动化液体处理机器人和荧光板读者读出。基于抑制30%的截止,计算命中率是3%属于anthracyclins候选药物和tetracyclins家庭。

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质谱分析

化学发光和荧光读出的一个限制是它是一种间接测量的生物活性。安德烈亚斯Luippold博士等人最近发达高温超导的方法使用质谱分析。作者认为,质谱是一种label-free技术,并提供了直接的证据基质产品转换更多生理相关的药物发现。这种方法也风险降低复合干扰从而导致假阳性和阴性,和它不需要定制的信号介质来放大信号,比如在荧光读数。然而,到目前为止,它一直具有挑战性的整合质谱与液体处理机器人和缓冲区用于质谱仪也可以不兼容的与保护酶活性的蛋白质。

Luippold和同事配置matrix-assisted激光解吸/电离飞行(MALDI) - (TOF)设备和安装用合成机器人,让它兼容1536 -孔板(或4 x 384 -孔板)。这使健壮且可再生的化验样本盘子和转移矩阵解决方案到MALDI目标板,允许他们屏幕~ 4900图书馆抑制剂对蛋白酪氨酸磷酸酶1 b -一个已知的治疗的治疗目标糖尿病和肥胖。作者也表现进行比较,并对生化分析的方法和自动识别技术。一百万数据点(即生成。,筛查一百万化合物/分子片段),MALDI-TOF高温超导方法仅仅需要5.1天而不是11天生化试验和7天自动识别技术。

真正的高通量分析运输活动的屏幕

两个关键ADME(吸收、分布、代谢和排泄)属性用于预测在活的有机体内性能的候选药物的渗透细胞膜的能力和潜力为跨膜转运蛋白作为衬底。下载这个程序注意发现系统敏感,可再生的和准确的。

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电池系统

影响中枢神经系统疾病的发病率正在上升高失败率中枢神经系统药物候选人中依然存在,因为他们无法通过血脑屏障(BBB)。中枢神经系统药物的成功率只有7%它需要大约10.5年开发治疗在这个领域,这是大大超过其他疾病。Elisa莫亚博士阿图瓦大学的研究员最近和他的同事们发达一个小型在体外BBB模型来研究药物毒性和BBB渗透速率的影响早期药物发现之前昂贵的临床前研究。

莫亚突显出一些高温超导在这种背景下的优势:“BBB在体外领域,临床前研究阶段,高温超导的发展是至关重要的原因。例如,它使研究人员评估大量的药物/化合物迅速,更好适应所需的高产量早期药物发现中枢神经系统化合物的发现。”她还指出,他们的方法可以减少材料和塑料垃圾,并允许研究人员排除弱候选人在早期,从而减少所需的进一步测试使用在活的有机体内模型。

基于专利和成熟的人类”在体外BBB模型由阿图瓦大学,我们开发了一个小型和自动复制。复制使用96 -系统格式结合自动化技术,”笔记莫亚。

人类BBB创建的团队在体外模型使用内皮细胞来源于CD34 +造血干细胞分离人类脐带血和播种不同数量的细胞为96孔板插入。BBB的主要细胞类型的周,也是播种孔板的底部。作者然后BBB完整性评估通过分析荧光paracellular的运输标记,荧光素钠,过去的内皮细胞层。当莫亚和同事比较的BBB完整手动创建,并且,他们可比在不同板格式,建议成立一个紧密的网络。共焦成像还证实adherens结蛋白的存在,如钙粘蛋白和紧密连接蛋白像claudin-5 BBB播种的机器人。

接下来,该团队筛选了一组药物等安非他酮免费/的值的分数比大脑的/等离子体是已知的人类吗在活的有机体内。结果表明,自由的分数比相应的药物测试使用小型BBB模型是相似的在活的有机体内数据在人类身上,强烈的相关性(R²= 0.8808)。当火山泥等人的BBB完整性测试他们的微缩模型,他们还发现,毒害神经的药物鱼藤酮极大地扰乱了BBB在BBB完整性影响non-neurotoxic化合物如对乙酰氨基酚,进一步加强生理相关性的模型。

“我们发现这一点在体外BBB模型能够实现预测结果,适用于药物化合物的高温超导,”莫亚补充道。虽然他们的效用模型已经证明,重要的是要注意一些关键的局限性,包括将只有两个细胞类型和动态流环境的缺乏。

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RNA序列

RNA序列是一种强大的方法来理解药物的影响。这种方法使用RNA转录组作为一个代理,但是当前可用的技术通常是低吞吐量,昂贵的和人力密集型。朝阳你们博士和他的同事们开发了一种具有成本效益的RNA序列为高温超导命名协议DRUGseq通过放弃冗长的核糖核酸纯化步骤和使用多路复用策略。药物治疗后,细胞溶解了,信使rna直接反向转录(RT)。团队还介绍了具体的条形码为RT引物使他们从个别井池的互补,减少劳动需要多井处理。

进一步降低时间和成本,你们和他的同事们还测试了减少阅读的影响深度的数量基因的差异表达基因发现和捕获的准确性后药物治疗。DRUGseq图书馆在2和1300万测序读/传统相比4200万年读每样例中,甚至在浅阅读的深度,基因表达在井是一致的。

团队的下一个应用DRUGseq屏幕的433种化合物库与已知的目标。检测到的差异表达基因的数量DRUGseq相关的数据连接图大型数据集的细胞扰动由于药理治疗,尽管使用不同的技术平台。

最后,作者用DRUGseq比较CRISPR敲除的效果和化合物抑制有效的化合物,环己酰亚胺,反对RPL6。他们发现,虽然CRISPR治疗水平的降低RPL6信使rna,放线菌酮没有。然而,转录组的概要文件被发现更相似的机制和治疗相比,DMSO被聚集到一起治疗的新控制样本。作者的结论是通过强调DRUGseq超过竞争对手的优势平台等PLATE-seq的吞吐量和更低的计算偏差。

“这项工作可以使成千上万的基因的转录分析跨到成千上万的井成本效益和它兼容现有的化合物筛选自动化在工业环境中。挑战在于,它需要自动化筛选前期投资真正的成本效益。记录俘获效率也可以提高测试各种反应条件,从而提高检测灵敏度和较低的测序成本,“你们说。

他继续说道,“我们希望更多的实验室将采用和改进这项技术在未来。作为一个延续原来的研究中,最近的一次手稿现在已经提交bioRxiv我的同事,更严格地测试平台,使得分析工作流向公众开放。”

结论

药物发现的成功率不断下降会导致无法满足临床需求,价格更高的药物在制药公司寻求恢复他们的研究和发展的投资。高温超导策略筛选大量化合物库与速度和成本效益。传统方法如荧光读数和细胞培养模型可以结合自动成像系统、液体处理机器人和小型化,但往往依赖间接测量的生物活性而质谱仪可以集成到高温超导工作流促进分子碎片和活动的直接测量。最后,随着测序技术的快速进步,RNA序列与高温超导产能有望成为一个强大的工具,使小说复合机械的研究,复合再利用和识别的基因转录与CRISPR基因网络编辑。