高通量筛选:使用更智能的方法进行发现

高通量筛选(HTS)是药物发现中公认的一部分其中包括利用自动化设备快速筛选大的小分子库，以识别对生物靶标具有活性的化合物(称为hits)。

“如果没有某种可靠的低容量检测，高通量筛查是不可行的，”他说凯瑟琳Kettleborough他是支持转化研究的医学研究慈善机构LifeArc的生物学负责人。“我们在384孔的微量滴定板上做所有事情，但有可能进一步降低到1536孔的格式。”

HTS通常是寻找活性化合物的第一步，有可能进一步发展为候选药物或化学探针，以帮助推进生物学研究。

“如果你正在研究一种非常新颖的药物靶点，关于如何开发筛选试验的先例可能很少，”凯特尔伯勒解释说。“所以中间步骤可能是尝试找到一些与它结合的东西，作为一种工具来处理它。”

近几十年来，研究的重点一直是通过提高自动化、小型化和大规模数据分析来提高HTS能力。

“在大型工业设施中，现在每天可以对成千上万——甚至多达一百万种化合物进行筛选，”他说马修·劳埃德巴斯大学药学和药理学高级讲师。

但学术研究人员可能受到预算限制或无法使用完整的HTS设施，他们正在转向更智能的筛查策略。

筛选化学起始点

在高温超导技术的帮助下，寻找对有希望的新药物靶点(如参与疾病关键途径的酶)具有活性的化合物，通常将从筛选包含数千种化合物的文库开始。第一步是设计一个合适的 在体外 能够可靠地测量所需功能变化的测定方法。

“例如，你可能正在寻找一种化合物，可以阻止目标酶的活性，”劳埃德解释说。“在这些情况下，最常见的方法是建立基于荧光的检测方法，测量产物的形成，并寻找表明酶抑制的信号中可检测到的下降。”

虽然HTS中使用的分析类型取决于目标，但它需要足够简单，以实现小型化和自动化。其他读出方法包括检测颜色或发光的变化或可能涉及更复杂的方法，如 质谱分析 或 基于单元的化验 ．

对最近发现酶抑制剂的HTS运动的分析表明 命中频率在很大程度上独立于库的大小，但与Z”测定的价值 这是一种统计方法，用来衡量找到一个成功作品的难易程度。

Lloyd说:“你可能期望典型的HTS检测的准确率在0.5%到1%之间。”“但有些目标更困难——你最终可能会达到不到0.1%的目标。”

MTT细胞增殖、活力和细胞毒性试验

MTT细胞增殖试验是一种常用的比色法，用于评估细胞代谢活性。这种广泛使用的，快速和定量的基于细胞的测定方法可用于测量多种细胞类型的细胞增殖，细胞毒性或细胞活化。下载此应用程序说明，了解如何使用移液机器人进行这种分析可以减少时间和成本，允许处理不同的板格式等。

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完善暗杀名单

假阴性结果意味着失去机会，而假阳性结果则会导致时间和资源的浪费——在筛选大型复合库时，这些数字变得尤其有问题。

“图书馆里的许多化合物都是小的、有机的、不太溶于水的，”劳埃德说。“这些化合物倾向于形成聚集物，可以干扰酶分解底物的能力，导致明显的抑制作用。”

这种抑制在很大程度上依赖于实验条件，通常通过洗涤剂(如0.01% Triton X-100)的存在而降低。但是，为了完全抑制聚集物的形成，可能需要将洗涤剂的浓度提高到0.1%，这有助于消除后续检测中的许多假阳性。

劳埃德说:“如果你只剩下几十个点击率，这可能是小屏幕上的典型情况，那么对所有这些点击率做剂量-反应曲线可能是可行的。”“但如果你仍然有数千个，你可能需要进行更多的分析来进一步减少它们。”

HTS的总体目标是缩小主动命中的候选名单，以进入命中-先导优化，这包括对化学结构进行小的调整，以生成一系列密切相关的化合物，以供进一步测试。

“在这个阶段， 药物化学家 我们需要检查剩余撞击的结构，以评估是否值得进一步研究，”劳埃德说。“一种化合物需要在合成上易于处理，这样才有可能产生一系列类似物以供进一步测试。”

监测t细胞衰竭和免疫治疗效果

程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)的高表达是t细胞衰竭的主要驱动因素，可以被几种药物靶向来逆转衰竭，并恢复t细胞的能力。有效监测t细胞表面标记物、细胞因子和表达模式对进一步的免疫治疗研究至关重要。下载此应用程序注释，了解细胞分析仪如何允许分析多个检查点抑制剂和激活标记，并可以提供离散细胞群的全面分析。

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质胜于量

虽然工业实验室可以筛选含有大量化合物的文库，以确定匹配的化合物，但学术研究人员可能需要一种更适合资源有限的实验室的替代策略。

“这需要筛选更小、更精细的复合库，”凯特尔伯勒说。

代表就是一个例子 LifeArc索引集 该组织收集了大约1万种类似药物的化合物，这些化合物是从该慈善机构更大的约15万种化合物的多样性收集中汇编出来的。该图书馆可与世界各地的学术团体共享。

“这几乎是学术团体的一站式服务——节省了他们购买更大的复合收藏的成本，”凯特尔伯勒说。“在这个小集合中确定初始目标后，他们可以从我们更大的多样性集合中的相关集群中获得类似物，以便快速跟踪。”

该指数集经过精心设计，以增加识别化学可处理命中的机会，同时最大限度地提高化学多样性。一个巨大的挑战是如何选择高质量的化合物——既要避免HTS的假阳性，又要将时间和资源投入到可能在后期被淘汰的热门化合物上。

凯特尔伯勒说:“我们最初使用计算方法根据需要填充的化学空间来选择化合物，然后与药物化学家共享这些结构以进行完整性检查。”“然后我们只添加那些被两位化学家独立批准的分子，至少有合理的机会进入药物发现的下一个阶段。”

结合hit模拟随访筛选LifeArc指数集提供了识别有进一步开发潜力的化合物的良好机会。

应用这种更具成本效益的筛查策略的一个例子是 寻找新的甲基酰基辅酶a消旋酶小分子抑制剂(AMACR) 这是一种对分解体内支链脂肪酸很重要的酶。它是前列腺癌和其他癌症的一种新型药物靶点，但由于开发合适的筛选试验面临挑战，以前的药物发现工作受到了阻碍。

Lloyd说:“我们建立了一种比色法，基于使用无色底物，AMACR分解成亮黄色产品，导致吸光度发生可检测的变化。”

研究人员使用这种方法筛选了2万多种类药物化合物，其中约一半来自LifeArc指数集，从而成功识别出模拟化合物的活性簇，作为化学优化的潜在起点。

高通量板材分选

微量滴定板分选是一项强大的功能，它利用了流式细胞仪和液滴细胞分选固有的单细胞分辨率，但它提出了独特的挑战。具体来说，必须精确地将细胞定位到每口井中，以确保细胞直接沉积到潜在的小体积捕获液中。下载本白皮书，了解电池分选器如何在保持低液滴充电电压和处理非常高的事件和分选率的同时提供精确的分选。

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一种更聪明的HTS方法

在过去的几十年里，HTS领域发生了一场革命——能力的提高使得制药公司能够筛选前所未有数量的化合物，以确定成功的化合物。

劳埃德说:“我怀疑我们现在已经达到了小型化和自动化的极限。”“使用这些大型屏幕的一个主要挑战是，最终会导致工件数量的大幅增加。”

未来可能会出现更智能的筛查策略。

“可能会从筛选越来越多的化合物转向更加关注质量——并使用人工智能和迭代筛选来为进一步研究的分子选择提供信息，”Kettleborough预测。