免疫组织化学技术,优势、局限性和应用程序

免疫组织化学(包含IHC)是一个重要的评估工具,属于免疫染色技术和利用抗原的伞- - - - - -抗体结合研究目标分子在组织的地位。包含IHC,结合显微镜和图像分析技术,已成为一个非常强大的工具,它提供了一个直接可视化的组织抗原使用标记抗体的抗原。由于多功能性,简单和负担能力的技术,包含IHC现在不可或缺的组织学、病理学、癌症生物学、神经科学和药物发现。

抗体小蛋白质分子表达的自然身体的免疫系统以应对外国分子的条目(抗原)和帮助中和。因此,抗体作为防御有害外来微生物和他们的产品。美丽的抗原- - - - - -抗体反应是每个抗体只针对部分抗原,称为抗原决定基,并且不绑定其他分子,其目标不匹配,包括人体自身的分子。所有免疫染色技术,包括包含IHC,利用抗原的这一重要属性- - - - - -抗体特异性反应,确保检测的单个分子类型成千上万的环境不同(图1)。

图1: 的图解表示抗原的特异性 - - - - - - 抗体反应,使单个目标的检测和定位环境成千上万的细胞内分子。

而这一重要技术的发展不可能是不可能发现的抗体由埃米尔·冯·贝林和Shibasabura北里1890年,¹直到1923年,抗原- - - - - -使用标记抗原抗体复合物是由迈克尔发现海德堡。²这是紧随其后的是约翰·理查森Marrack描述抗原的性质的工作- - - - - -抗体反应。Marrack是第一个附加一个染料在1934年抗体。^3,4与荧光标记抗体的标记,荧光素,和各自的检测抗原在细胞和组织是由阿尔伯特·休伊特孔斯曲面等人在1941年⁵并启动免疫染色的革命。⁶技术发展和改进之后,已经成为一个至关重要的发现和诊断的工具。

什么是免疫组织化学(包含IHC) ?

包含IHC采用组织学、解剖学、免疫学和生物化学检测数量、分布和定位一个特定的目标在一个组织。感兴趣的抗体分子,通常一种蛋白质,产生在不同物种的生物和通常由另一组标记或辅助标记抗体。组织样本准备以下专业技术,使入口的抗体,检测到和标签使用光或电子显微镜(图2)。

图2: 免疫组织化学染色对色氨酸羟化酶2,揭示人类中缝背羟色胺神经元和他们的预测。信贷:人类蛋白质图谱,图像可以从v21.1.proteinatlas.org 。

有什么区别免疫染色和免疫组织化学染色(包含IHC染色)?

疣是一个总括的术语,它包括了所有的技术用于分子采用抗原的检测- - - - - -抗体反应。免疫组织化学和免疫组织化学染色法是一种特定用例疣状的抗原- - - - - -抗体反应是用于研究分子的状态组织(来自希腊组织,这意味着组织)。

免疫组织化学和免疫荧光之间的区别是什么?

应用免疫组织化学和免疫荧光的基础上样本类型和的方法检测用于免疫染色技术。免疫组织化学是指目标抗原的评价组织当检测方法可以显色或fluorogenic。免疫荧光,另一方面,可能是指目标抗原在细胞和组织的评价,特别是涉及的检测荧光标签(荧光团)(图3)。

图3: 酪氨酸羟化酶的免疫荧光显示中脑多巴胺能神经元的老鼠。 信贷: 人类蛋白质图谱,图像可以从v21.1.proteinatlas.org。

免疫细胞化学和免疫组织化学的区别是什么?

虽然免疫组织化学涉及到研究抗原的状态的组织样本,免疫细胞化学,是指免疫染色时感兴趣的样品细胞在文化(来自希腊阶段,这意味着细胞)。

免疫组织化学是如何工作的呢?

免疫组织化学的成功取决于多个参数。因此,科学的方法和细致的实验设计是获得可靠和可再生的关键数据。

给一个简短的总结的步骤,⁷包含IHC在薄片上执行的组织从有机体获得下学习。这些组织部分加工允许抗体的条目,就会特别感兴趣的抗原结合。通常,第二抗体将结合特别适用于主要的抗体,使检测。在显色检测方法,二级抗体标记的酶催化显色反应。在免疫荧光检测方法,二级抗体标记的荧光团可以直接荧光显微镜下观察。

现在让我们考虑到不同的参数需要在执行包含IHC记帐。

组织:组织的来源,即,the species of the organism of study and the organ of interest, will determine how the tissue is harvested and prepared for slicing. Prior to performing the experiments, it is vital to refer to literature pertaining to the specific organism to understand the techniques involved in harvesting the tissue and the special care that must be taken when performing IHC. Further, it is important to note that prior to fixation, all tissue must be handled in cold conditions and quickly to prevent rapid decay and drying.

目标:目标的水平和亚细胞定位包含IHC实验设计中是极其重要的。例如,检测到更多的大量表达蛋白可以用更少的工作和主要抗体标记荧光团可以满足它的检测。然而,那么丰富的目标需要的检测信号放大方法。在细胞内的定位目标所需的直接影响透化作用的程度。因此,当核蛋白质需要严厉surfactant-based透化作用治疗,细胞质组件可能发现使用一个相对温和的治疗。检测细胞内的膜蛋白可能通过冻融。⁸

抗原决定基:抗原决定基的小区域的三维表面抗原抗体会特别窘迫。是很重要的,抗体的抗原决定基将绑定暴露在包含IHC抗体时添加。抗体识别的抗原决定基可能有时会成为掩盖在组织处理和步骤,如抗原检索,可能需要暴露抗原决定基。

固定方法:固定是指组织形态和细胞结构的保护处于静止状态的固定目标。它可以防止组织变性,使长期储存。通常,收获后不久,组织是沉浸在一个适当的固定的几个小时之前,对切片进一步处理。最小化之间的时间组织收集和固定,实现统一的固定,整个动物transcardial灌注与固定剂固定在动物模型的首选方法,如啮齿动物。

固定液:固定时间和固定液的选择取决于抗原的组织和兴趣和需要优化。^9,10虽然固定不足可能导致损坏的组织形态,长期固定会导致屏蔽的抗原。固定液分为三类:醛(甲醛和戊二醛)、醇(甲醇和乙醇)和acetone-based固定液。最常用的固定剂是4% (w / v)多聚甲醛溶液在磷酸缓冲盐(PBS)。

样品制备方法:样品制备包含嵌入固定组织块在一个矩阵,使组织切成段的厚度。这一步需要认真执行,以确保组织是否正确设置矩阵的选择。两个常见的样品制备方法是formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)和冻结。FFPE涉及组织样本的脱水前逐渐在石蜡包埋。冻结涉及低温贮藏的样本使用蔗糖在嵌入之前在最佳切削温度(10月)化合物。一旦石蜡包埋组织块或冻结,他们可以存储在适当的条件下持续时间更长。

分割方法:包含IHC薄片的组织执行。部分的厚度和均匀性是非常重要的,以确保有效渗透的抗体和适当的成像组织。FFPE组织通常据切片机在室温下,而冷冻组织切片在零度以下的低温恒温器。部分可以获得沿冠状、矢状或横向平面的组织。然后部分安装在带正电的幻灯片IHC过程中确保固定的部分。

预处理的组织部分:一旦组织部分已经准备好了,他们可以处理渗透促进抗体的免疫原性反应。虽然FFPE部分需要deparaffinized使用有机溶剂,如二甲苯,其次是补液一步,10月嵌入部分化合物可直接用于下游加工。冻结部分接受更少的处理步骤,该方法更敏感的检测的蛋白质。然而,FFPE提供良好的形态保存和帮助实现更薄的部分(如薄2微米)。

抗原检索方法:甲醛固定会导致屏蔽的抗原表位。抗原检索因此需要揭开抗体的抗原表位,让他们可以绑定和往往是执行。¹¹这一步是重要的在执行包含IHC FFPE组织,但可以为冷冻组织切片和过于苛刻可以省略。抗原检索可以通过应用程序实现的热量(热诱导抗原决定基检索:海尔)或通过酶促降解(proteolytic-induced抗原决定基检索:码头)在一个合适的缓冲区。

透化作用:透化作用是一个重要的第一步,它显示细胞的质膜组织疏松,从而允许的条目包含IHC试剂和抗体。常规表面活性剂,如特里同x - 100, Tween-20、皂素和洋地黄皂苷用于实现透化作用。然而,对于保护细胞内的膜的温和的透化作用,部分可能会受到冻融过程。各种试剂,如甲醇和丙酮,还permeabilize组织,当使用这些固定液这一步可以省略。表面活性剂的浓度和孵化的时候使用的固定剂等因素基础上,确定组织切片厚度和亚细胞定位感兴趣的抗原。

阻断缓冲区:尽管抗体- - - - - -抗体抗原结合可以非常具体,有些可能坚持某些非特异性细胞组件由于各种分子内的力量在起作用。孵化前在阻断缓冲区的抗体有助于防止非特异性结合的抗体的组织。常用的屏蔽代理是正常的血清和牛血清白蛋白。当使用显色检测,阻断内源性酶活性也需要和可以通过使用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活动或左旋咪唑阻断内源性碱性磷酸酶活性。

检测方法:目标的检测抗原可能是直接的,标签是直接连接到主要的抗体,或间接,标签或一种酶,这种酶催化显色反应与二次抗体。此外,信号放大方法可能适用于提高信号检测的灵敏度。

主要的抗体:直接结合的抗体抗原的抗原决定基的兴趣被称为主要抗体。主抗体的选择包含IHC实验设计是一个重要的一步¹²和一个需要确保所选抗体是特定于该物种在研究。特异性靶抗原的抗体也需要彻底的评估。主要的抗体可能是多克隆和单克隆:虽然多克隆抗体由多个个体抗体分子可以识别不同抗原表位相同的目标,单克隆抗体识别相同的单一抗原决定基。主要抗体的浓度需要通过仔细的实验达到最好的结果。

二次抗体:二级抗体抗体识别的主要抗体,从而使目标抗原的检测。二次抗体通常标记酶促进显色检测的信号放大,或者他们可能标记荧光团。

信号放大:对目标抗原表达在低水平,信号放大可能需要执行改进技术的敏感性。几个信号放大策略,包括使用,avidin-biotin复杂(ABC)方法,标记streptavidin-biotin (LSAB)方法和tyramide信号放大(TSA)。¹³

标签:标签用来探测目标抗体连接到一级或二级抗体和可能fluorogenic(如免疫荧光的情况下)或显色。Fluorogenic标签,如荧光素和tetramethylrhodamine (TAMRA),可以直接在荧光显微镜下观察。显色方法包括显色底物的转换,如3、3 ' -diaminobenzidine (DAB)和5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) /硝基蓝四唑(电视台),彩色产品的一个antibody-conjugated酶等,辣根过氧化物酶(合)和碱性磷酸酶(美联社)。

复染色:组织通常与次生核或彩色标签的所有细胞的胞质染色和帮助可视化IHC-labeled细胞的一般形态组织,从而提供一个对比。复染色用于显色包含IHC标签包括苏木精、核快红和伊红;而使用fluorogenic包含IHC标签包括4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Hoechst33342 propidium碘。

安装:准备组织部分安装在一个适当的介质折射率,促进了成像显微镜下,保护光漂白的荧光标记的部分,防止干燥的部分。常用的安装媒体包括DPX、合成树脂和glycerol-based安装媒体包含不变色剂荧光标记部分。

多路复用:多路复用是当一个实验需要执行多个目标抗原的伴随的调查。多路复用荧光团标签是首选方法,因为标签发出荧光的可用性在整个可见光谱和相邻的波长范围。必须特别注意防止大的二次抗体在执行多路复用。

成像方法:显色标签可以使用光学显微镜检测。荧光或共焦显微镜用于荧光团的检测。电子显微镜可以用于成像后免疫组织化学与胶体金颗粒标记。¹⁴

控制:适当的控制是不可或缺的确定一个包含IHC实验结果的真实性。组织样本中靶抗原的表达可以作为一个积极的控制。同样,一个样本中目标抗原是没有可以用作消极的控制。此外,抗体控制需要用于验证的特异性抗体。¹²

一个例子免疫组织化学协议

把所有这些变量在一起,一个通用的协议包含IHC将包括以下步骤。¹⁵(图4)。

1. 固定:目标组织是收获的有机体和固定在4% (w / v)甲醛在4 ~ 24 h°C。
2. 样品制备和切片:FFPE部分,组织使用酒精梯度脱水,石蜡包埋,2 - 4米米厚的部分是获得并安装在幻灯片。冻结部分,组织是嵌入在10月化合物和4 - 8米米厚的部分切片和安装在玻璃幻灯片。
3. Deparaffinization:这一步是只为FFPE部分执行。玻片上的部分是在二甲苯deparaffinized然后患者使用酒精梯度。
4. 抗原检索:在这里通常是首选,可以由孵化的部分在柠檬酸缓冲(pH值6.0)高压锅压力下(3分钟)或微波炉(20分钟)。部分然后用PBS Tween-20洗两次(2 x 5分钟)。
5. 过氧化物酶阻断:阻止内生合活动,部分孵化在3% (v / v)过氧化氢溶液在室温下15分钟。这是紧随其后的是3 PBS Tween-20洗(3 x 5分钟)。
6. 透化作用:这一步是可选的;部分可能在0.1% (v / v)孵化Triton x - 100在PBS在室温下10分钟。部分用PBS Tween-20三次(3 x 5分钟)在继续下一步之前。
7. 屏蔽:部分孵化与3 - 5% (v / v)的同一物种的正常血清二次抗体是在室温下为30分钟。
8. 主要的抗体:部分在species-matched孵化主要优化浓度的抗体在室温下1 - 4小时或隔夜水化室在4°C。主要的抗体可以在PBS稀释或阻断缓冲区。这是紧随其后的是两个PBS Tween-20洗(2 x 5分钟)。
9. 二次抗体:部分培养在生物素化的二次抗体稀释到适当的浓度(如1:1000)在PBS 30最低为1 h在室温下。部分与PBS Tween-20洗了三次(3 x 5分钟)。
10. 信号放大:这是紧随其后的是孵化的部分在PBS streptavidin-HRP在室温下30分钟。部分与PBS Tween-20冲洗三次(3 x 5分钟)。
11. 显色检测:部分培养方案包含1% (w / v)轻拍(250μL)和0.3% (v / v)过氧化氢(250μL) 5毫升的PBS在室温下1 - 3分钟,直到棕色了。这是紧随其后的是三个洗蒸馏水(3 x 5分钟)。
12. 复染色:的部分可以被孵化的苏木精复染色1分钟。
13. 安装:部分然后使用酒精梯度脱水,DPX安装。
14. 成像:部分可以使用光学显微镜成像。

图4:的图解表示包含IHC的关键步骤。

免疫组织化学分析的优点和局限性

的一些主要优点和局限性包含IHC总结在表1所示。

表1:包含IHC的优点和局限性。

的优势	限制
负担得起的和简单的程序可以利用很少的资源	特异性的抗体可以使用适当的控制变量,需要进行彻底检查
强大的技术来研究定位和存在/缺乏组织和细胞水平的目标	该方法半定量,不能可靠地确定目标的绝对丰度
石蜡包埋和冷冻组织样本在需要时可以存储和访问	组织是高度处理,可能会导致信息丢失的自然状态
染色组织部分可以存储和指时必需的	包含IHC是一个多步骤的过程和变化可以在任何阶段引入导致结果重现性差16

免疫组织化学是什么用的?

免疫组织化学是一个简单的和具有成本效益的技术,它已成为病理学家和科学家们的一个重要工具。这种技术的一些应用程序列出:

• 在肿瘤生物标志物评估:包含IHC检测生物标志物是一个非常受欢迎的工具在癌症诊断的发展以及新的生物标志物。包含IHC允许肿瘤检测、分级和分类,除了预测肿瘤预后和理解的反应肿瘤治疗模式。IHC-based生物标记已经成为乳腺癌的诊断和治疗至关重要,¹⁷前列腺癌,¹⁸胰腺癌,¹⁹肺癌,^20.膀胱癌,²¹结肠直肠癌²²和卵巢癌。²³
• 传染病的诊断:包含IHC作为探测和识别的一个重要工具从感染者致病性抗原的组织样本,可以帮助治疗传染性疾病。²⁴细菌等病原体,巴尔通氏体属昆塔纳,鼠疫杆菌,梅毒螺旋体,沙眼衣原体;病毒等病原体,人类疱疹病毒8型(HHV8), eb病毒(EBV),人类免疫缺陷病毒(HIV);真菌病原体等,白色念珠菌和新型隐球菌var. gattii;和原生动物的病原体等,恶性疟原虫和鲁兹锥体已经成功地使用包含IHC确认。
• 评估神经退行性疾病:异常蛋白质构象和聚合可以使用包含IHC识别和评估,许多神经退行性疾病的常规功能,包括阿尔茨海默病(AD)、慢性创伤性脑病(CTE)进行性核上的麻痹(PSP),选择病,路易的身体疾病,多系统萎缩(MSA)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。²⁵
• 人类蛋白质图谱:包含IHC导致了大数据的时代通过使人类蛋白质组的映射。²⁶的人类蛋白质图谱²⁷是一个免费的和宝贵的资源,包含组织表达水平信息包括90%的蛋白质编码基因。

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