液体活检的成长
处理GeneStrat液体活检测试现场Biodesix CLIA / CLEP-certified实验室。
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工业化、验证的
液体活检的决策矩阵定义的示例,方法,分析平台,和所需的输出。为典型的平台——像PCR分子检测或门店——样本采集和准备是至关重要的,在极低浓度分析物常常存在内的样本,与似乎压倒性数量的干扰。
在他的彻底的检查黑色素瘤的ctDNA Benoit巴瑟格勒诺布尔大学医院(法国)指出癌症相关基因的多样性在黑色素瘤患者的血浆。对这些分子靶点和定量方法,验证了DNA从固体肿瘤活检相比,等离子体浓度疾病的生物标志物和阶段有很大不同。也显著影响疗效和治疗疾病回归:“生物学复发由几个星期之前放射性复发的迹象。”
癌症病人通常有高水平的野生型(正常)游离DNA,干扰传统的基于PCR测序方法,例如Sanger测序或焦磷酸测序。这些方法量化ctDNA只有在非常高的水平,这只不幸的是发生在晚期疾病,或者当隔离(或扩大)方法是敏感和特定突变的DNA。
敏感qPCR挑战液体活检
液体活检微创和相对廉价的有关疾病的信息来源,但也给分析带来了挑战。Exiqon,试剂盒公司提供非常具体和准确的PCR解决方案旨在最大化见解从液体活检,尽管RNA含量低,高水平的抑制剂和易感性preanalytical变异。
“我们有针对性的液体活检在我们的产品开发工作。我们的专家理解和创造了独特的挑战,全面、易于使用的解决方案。”
玛丽Lunn
产品管理总监,
Exiqon / S、试剂盒的公司
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玛丽Lunn
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巴瑟提到一些新技术,如allele-specific扩增PCR耐火突变系统(武器),珠乳化放大和磁学(传送)技术,allele-specific PCR(AS-PCR),数字PCR滴(ddPCR),下一代测序(门店),等等。这些方法分析灵敏度低至0.005%的突变体与野生型相比,DNA。
然而收集目标DNA内的其他基因是一个大海捞针锻炼,马克Dupal说,全球投资组合经理微流体和自动化,应用基因组学PerkinElmer(数据、麻萨诸塞州,美国)。”与其他所有游离DNA,分析师必须提取尽可能多的目标DNA,和尽可能少的干扰DNA,。”
基于磁珠分离净化设备是常见的。大多数涉及样本孵化附带粒子代理绑定核酸,紧随其后的是应用程序的外部磁场,洗涤,目标DNA的释放。
PerkinElmer的解决方案,chemagic™仪器和辅助线,更适合自动化的样品制备,据该公司介绍,比常规方法更敏感和准确。chemagic系统采用磁化棒插入到样本,这珠子带着目标。珠轴承感兴趣的DNA释放de-magnetizing棒,从而减少手动步骤的数量。
QX200™AutoDG™滴数字™PCR系统
在一个复杂的世界,未来即将得到简化。自动滴生成现在数字PCR更加简单。Bio-Rad滴数字PCR系统重新定义了核酸检测的局限性。现在自动化液滴发生器使这项技术的可伸缩性。找出自动液滴生成将使液滴数字PCR实际吞吐量的需求。
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工业化
自动化将是必不可少的一样液体活检从研究实验室迁移到诊所lab-developed诊断测试或批准。明显的好处是更高的吞吐量,更大的一致性,消除人为错误,所有这一切早已工业化实验室诊断的特征。这同样适用于液体活检,特别是在样本收集和准备步骤。
Biodesix(美国科罗拉多州博尔德)最近演示了一种新的方法来从血浆中提取RNA流传。为此,Biodesix与一起合作Biotek(加拿大安大略省Thorold)专门从事样本收集和保存。
分子检测蒸汽,自动化将日益重要的保持一致性和实现高质量的化验结果。Biodesix寻求了一起自动化Biodesix GeneStrat测试平台在不牺牲性能。
GeneStrat是液体biopsy-type基因组分析,指导患者使用靶向治疗肺癌。测试量化循环肿瘤DNA和RNA的基因突变和变异使用高度敏感的数字PCR由Bio-Rad滴。治疗医生GeneStrat测试的肺癌患者。表皮生长因子受体敏化的测试交付结果,EGFR阻力,喀斯特,BRAF突变,针对有eml4 - alk、ROS1 RET融合变异。
具体改进GeneStrat涉及商用laboratory-developed测试自动化(LDT)针对有eml4 - alk的mRNA融合变异,基因与肺癌。LDT是一个特定的监管指定一个在体外在一个实验室诊断,开发和使用。升级可以自动化等离子体RNA隔离和RNA浓度的过程。
“我们一起工作一起Biotek修改他们的血浆/血清循环和Exosomal RNA净化设备和RNA清理和浓度Micro-Elute装备,”加里·Pestano说博士,副总裁的开发和运营。”汉密尔顿的过程自动化麦蓝灵气平台。”
显示液体活检已经走了多远,Pestano描述GeneStrat作为替代,而不是常规活检,但取代传统的肿瘤组织基因测试,或作为一个测试选项前肿瘤组织。
GeneStrat经常使用另一个Biodesix化验,VeriStrat®, blood-based蛋白质组测试为非小细胞肺癌患者测试为阴性EGFR突变。”这一战略整合基因组和蛋白质组生物标记告知肿瘤突变状态和测量肿瘤病人的免疫反应和侵略性的癌症,”Pestano补充道。
PCR-proliferation
基因扩增方法,大多数pcr,作为前端门店或为主要吸引力在许多液体活检。PCR的临床相关的分支的数量正在增长,甚至到分支的分支。
dana - farber癌症研究所开发,介绍了冷PCR自然医学纸2008年,随后授权Transgenomic(美国康涅狄格州纽黑文)。几组,包括Transgenomic,后来改进的方法。冰冷的PCR,这样的变化,有几个优势在常规PCR,特别是等位基因特异性,广泛的样品验收,适合所有重要检测平台和灵敏度提高500倍。
利用这些优势,Precipio(美国康涅狄格州纽黑文),于2017年与Transgenomic合并,是商业化冰冷PCR (ICP)对液体活检。ICP优先丰富了突变的DNA序列在野生型DNA通过选择性放大,导致多达500倍增加敏感性识别突变与癌症有关,在序列改变检测低至0.1%。这个敏感性水平是公认的标准液体活检基因检测,并且可以申请病人监测治疗反应,疾病进展和复发。
液体活检的意义,在病人健康和医疗服务质量,需要研究如何目前利用液体和常规活检。
提供病人的信息状态,外科医生保留部分从实体肿瘤活检组织学和基因检查。他们得到的是,一次特定肿瘤的基因足迹的照片。“病人接受治疗肿瘤适应,和肿瘤的生物学改变,”笔记摘要达涅利,部宜兰Precipio的首席执行官。“由于这些变化,治疗可能不再工作。肿瘤停止收缩,开始增长。Re-biopsy几乎是永远做不完,所以没有任何新的遗传信息,从那个时候开始的医生常常在黑暗中工作。”
在某种程度上这是由于pre-genomic天延期的心态,当活组织检查的目的是对肿瘤的起源和阶段进行分类。患者安全的担忧,让他们第二(或第三)入侵和危险的过程中,除了成本,在许多情况下,最初的活检的主要原因仍是最初的遗传信息的唯一来源。然而临床医生离开的全部功能基因组分析表时避开周期基因测试。
”冰冷的PCR的最重要的价值是,它消除了成本障碍repeat-testing监测病人的当前状态,“Danieli解释道。“你不想知道化疗并不艰难地工作,经过几个月的治疗,当肿瘤CT扫描显示了增长,而不是萎缩,表明治疗停止工作。基于冰冷的液体活检PCR允许您测试经常需要,赶早班的改变。”
摘要达涅利冰冷测试部根据运行成本仅为150美元,相比之下,几千美元的价格竞争液体活检目前测试提供。
验证
底层的科学循环肿瘤DNA化验(ctDNA),或液体活检,超过了验证的方法建立在这些技术的引入。缺乏足够的标准是最严重的挑战。
SeraCare生命科学(米尔福德,马萨诸塞州,美国)组装一套基因组学临床验证和质量控制工具,最近被SeraseqTM骨髓髓RNA和DNA融合参考资料。液体活检的开发者使用这些参考标准以确保下一代测序(门店)的灵敏度和鲁棒性骨髓癌症化验。
分子分析骨髓癌症正在从传统singleplex方法如鱼和qPCR、多路复用挥动化验。Singleplex化验目标一个独特的基因序列。骨髓癌症可能涉及不同的突变,singleplex化验是昂贵和费时的。
骨髓突变和骨髓混合融合产品覆盖范围广泛的突变类型,从临床上重要的单核苷酸变异基因融合。
纯化的DNA突变工具包包含DNA混合物可操作的体细胞突变和基因背景的高度健康个体特征。“可操作的”突变基因差异医生找来检测特定的肿瘤类型。突变的基因混合代表和野生型基因中发现典型的患者样本中,野生型95%,5%的变异。“我们生产他们代表什么是基因分型试验可能会看到病人,”拉塞尔Garlick说,博士,首席科学官。
而不是特定DNA突变,可操作的RNA的RNA工具包包含一个混合融合。用户相同的协议转换为患者样本,他们雇佣到互补DNA,他们分析通过基因扩增,测序等。
通过复制有意义的基因变异的范围和相关频率对RNA和DNA,液体活检的产品将帮助开发人员和其他产品来验证分析性能的分析。这些套件,从某种意义上说,生产准备工作的典型的患者样本的遗传变异和融合,用户会在液体活检。他们作为标准——和一个独立的验证样品制备、分析和数据系统终端用户使用。
包地址标准差距液体活检与精心设计的设计的准备工作在网上感兴趣的分析平台,然后合成和精确的制定。包也可定制的具体目标。
“假设你想验证的试验罕见FLT3基因ITD突变与血液癌症。内部串联重复基因的外显子,是很难发现但我们可以设计所需的变体,放到一个混合,”Garlick说。“用户将有信心,如果他们可以在样本检测FLT3 ITD他们可以检测病人。”
枯萎收养?
采用液体活检需要时间作为科学家,医生,和报销方法定义的组织达到一个平衡点的内在潜力和局限性,和成本。仪表和信息学改善每周,液体活检仍然面临一个技术障碍,据SeraCare Garlick博士是比技术生物。
“液体活检已经敏感和鲁棒性。“检测限制0.5%的突变基因可能进一步走软。“挑战是肿瘤是否脱落遗传物质,并可检测的学位,进入血液。micrometastatic肿瘤,特别是,释放足够的物质可以被探测到?”
提高灵敏度只是答案的一部分,“一把双刃剑,”根据Garlick,频率如下约0.1%,生物和分析噪声信号来支配。”作为分析改善我们会看到假阳性下降和真正的积极向上,但不要指望一个阶跃变化技术性能的改善。进展将逐步增加。”
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