蛋白质质谱分析加速Biotherapeutics发现和保证质量控制

生物制药药物经历了稳定增长自从第一个重组蛋白生物的批准Humulin,人类胰岛素的生物合成的形式,在1982年。生物制药药物来源于生物来源和包括肽、重组蛋白,mono和多克隆抗体,抗体药物配合,细胞(如CAR-Ts,干细胞)、组织、毒素、疫苗、反义寡核苷酸,基因疗法。抗体在生物制药领域,包括增长最快的一类,在一定程度上受免疫的最新进展检查点抑制剂对癌症治疗。抗体占53%的全球首次批准从2014年到2018年7月,从2010年到2014年只有27%。他们也构成了2017年全球销量的65.6%,高于2011年的49.9%。

跟上这个快速增长的市场,研究先进的抗体特性和质量保证。蛋白质biotherapeutics天生异构、复杂,数量级比小分子药物,使分析的挑战。蛋白质结构是多层,主要氨基酸序列折叠成二级主题,这可能会进一步相互作用产生一个三级结构(即两个或两个以上的多肽)。(天车)此外,转录后修饰,如糖基化、磷酸化蛋白质结构进一步复杂化。最后,在生物环境中,可能与其他生物分子(蛋白质如蛋白质,寡核苷酸)形成复合物具有重要的生物功能。

正确的描述、发现和发展

质谱(MS)已被证明非常熟练描述蛋白质生物制剂,包括生物仿制药通过质量,保证他们的质量控制(QC)。”是一种巨大的女士在制药公司对于蛋白质和抗体特征,主要是因为它的用途对于医药的需求在产品开发和发布阶段,”Peter Liuni讨论蛋白质组学中心博士科学家dana - farber癌症研究所蛋白质降解。”(质)女士液相色谱检测肽在attomole敏感性,可以准确地制定你的产品非常重要,监测稳定性,并检测任何残留杂质。荧光化验如ELISA的通常达到这种程度的敏感性,但当抗体并不可用,能跳,女士通常提供所需要的。”

在主要结构层面,女士可以准确地确定多肽质量和氨基酸序列。“女士更先进的方法甚至可以量化的质量和相对构造高阶结构,如多聚体或非共价蛋白质和女士使用离子迁移protein-ligand复合物(IM-MS)在本土一样的条件下,试图保护生物的自然结构”,Liuni博士解释说。“好处是利用质谱仪的速度、高质量选择性,和敏感洞察本土一样蛋白质属性比较慢,低分辨率生化技术。然而,重要的是要注意,本土一样是正确的术语,因为持续的辩论关于比较气相液相蛋白质结构的有效性。然而,你可以获得丰富的信息疗法就是通过实现本机工作流女士。”

许多女士的方法也存在其他结构蛋白属性特征。“选择性,但是和其他技术,如凝胶排阻层析法(SEC-MS)女士和电喷雾电离(质)女士,在我看来,在这个阶段无可匹敌的。没有什么比能够为揭示proteoforms剪切宽度的女士。即使在生化分析可能保证产品是“纯”,运行在一个女士果然你会发现诸如小降解产物,工艺杂质,和各种你想要的产品,proteoforms”Liuni博士继续说道。例如,天车的差异性,如蛋白质糖基化,可以发生在各种蛋白质残留和由不同的聚糖。从制造过程变异性在糖基化可能出现;然而,由于糖基化会影响血清半衰期和非人的存在聚糖可能引起免疫原性反应,关键是确定精确的糖基化。糖基化分析女士可能是由各种各样的方法,最终确定两种多糖蛋白质上的铝及其位置。二硫键是另一个重要的结构性主题,便于折叠,借稳定,并给予正确的功能。因此,它是至关重要的,以确定二硫键的蛋白质疗法,尤其是对抗体拥有多个二硫键,因为它们固有的蛋白质功能和治疗效果。质和串联质(质/ MS),是首映方法二硫键映射能够识别内部和inter-chain二硫键的蛋白质结构。

氢氘交换女士(HDX-MS)是一种技术,利用交换的不稳定蛋白质氨基,羟基,与溶剂或硫醇氢氘。”这种技术是一种有趣的使用速度、选择性、和敏感的女士仪器识别的位置氘交换。它基于这样一个前提:暴露蛋白质表面会吸收更多的氘,而更少的暴露表面吸收少,给线索蛋白质构象变化,”博士Liuni描述的HDX-MS。“这是非常有用的,如果你感兴趣的是确定结构差异蛋白质配体当比较不同的候选人。也很善于观察动态差异在点突变体。制药公司很感兴趣使用HDX-MS作为一种技术来确定绑定的表面抗体或抗原疗法,尤其是核磁共振(NMR)或co-crystals并不可用。再次的前提就是地区不氘交换“阻塞”的东西——这通常是配体或蛋白质。这有助于区分从法律的角度看你的治疗从竞争对手的绑定的位置,而且从根本上理解的结构方面如何治疗有效地抒发响应目标。”

控制质量,预防问题

除了描述蛋白质生物的结构属性在药物发现和开发阶段,已成为一个强有力的候选人女士分析制造业的质量在最后阶段。凯文·范·科特系的副教授布拉斯加-林肯大学化学和生物分子工程,与行业合作,帮助公司开发一个女士管道分析杂质蛋白质生物制剂。“我的工作主要是与私人公司解决生产问题的生物制剂,主要是在开发的早期阶段。大多数的我的工作宿主细胞蛋白(HCP)的分析由学校从宿主细胞过程污染物女士用来表达蛋白质的生物,可以触发免疫原性病人的反应。我对学校的兴趣始于2012年当我在工作的三期临床试验项目是暂停,因为有些病人开发抗体产品的一些学校。美国食品和药物管理局(FDA)要求公司赞助的临床试验确定免疫原性的学校,我们和他们一起工作。我们还开发了一个针对质/ MS多反应监测(MRM)方法来跟踪这些学校,净化过程被修改了。从那时起,我们做出了许多HCP项目”。

使它适合女士的敏感性检测污染物。但它并非没有困难。“HCP的技术挑战的分析有很多女士,”范·科特教授说他的工作。“HCP女士的分析的主要技术挑战,产品存在蛋白质生物浓度远高于我们试图检测的跟踪等级的学校。对于抗体样本,这通常意味着在不到10 ppm的学校存在。女士仪器以来的最大动态范围约10⁵低,这意味着我们面临硬件限制实现ppm HCP检测。我们可以战斗重载列,但这是在牺牲电离抑制和探测器饱和女士。丰富的学校通过消耗产品的蛋白质样品是一个长期的目标,一些成功。大多数浓缩方法的问题是,许多的学校都是“搭便车旅行”,与蛋白质生物交互。因此,消耗的蛋白质生物样本还删除一些的学校。发布的方法黄等。(2017),这是非常简单和利用本机单克隆抗体的自然抗胰蛋白酶消化,曾在我们的手和其他实验室。”

HCP分析女士面临另一个挑战是样本的变异类型。“我们收到所有样品净化阶段,从澄清收获细胞培养瓶药物产品,”范·科特教授解释道。“因此,我们需要处理许多不同的样本矩阵,通常的一些示例组件(如辅料如渐变)女士是不相容的,因此,我们的样品制备和分析方法必须足够灵活来处理这个问题。每个新项目是一个新的挑战,但也有几个选项供样品预处理。”

除了技术实验挑战,HCP识别数据分析有它自己的一系列障碍。“最蛋白质组学搜索引擎没有最优设计检测跟踪等级蛋白质样品中。从low-abundance MS / MS谱的学校并不总是像一个希望,所以必须小心,以确保搜索引擎正确指出了肽。最大的问题在HCP数据分析处理假阳性。尽管设置严格的搜索参数,搜索引擎还是会犯错误,所以我们可以几乎从不隐式信任他们的输出。管理搜索引擎结果占用了我大部分时间在一个HCP项目——看着肽的MS / MS谱,提取离子色谱(XIC)集成,和同位素资料,以确保所有女士是一致的,可以标记为“真阳性’,”范·科特教授阐述了这一过程。

传统的方法包括二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(HCP分析2 d-page)和免疫印迹(WB),HCP-ELISA的标准。然而,一个HCP-ELISA需要抗体样本中的所有潜在的学校——这并不总是可能的。”超过ELISA女士在这方面,因为它是没有针对性和提供了一个无与伦比的的详细级别,”范·科特教授解释道。“知道特定的身份和相对丰富的学校可以通知一个理性的净化流程的修订并生成风险评估在任何剩余的学校对安全的影响病人的人口。我认为重要的是要记住,阐述了患者安全,保健当讨论当前和新技术——不仅仅是硬件和软件,但是技术如何帮助病人。”

女士有什么不能做的比其他技术HCP分析?”分析女士的一个缺点是,它有时会产生“太多的数据”,“范教授科特承认。“一个经常提出的问题是,我们怎么处理这些数据?”HCP-ELISA给我们一个结果,这很容易理解。现在我们必须处理所有这些女士个人的学校。这项技术仍然有改进的余地;仪器可以受益于一个更大的动态范围。数据分析过程将会受益于更好的用户友好的数据分析工具,可以很容易地理解非专家。我可以运行样本,过程数据,牧师的结果,和看我的电脑屏幕,告诉别人他们的HCP问题是什么——但转移报告这些信息仍然是另一个瓶颈。女士的步伐,然而在生物制药分析方面取得了进展迅速,和我有信心解决方案。”