认识细胞培养污染的罪魁祸首

空气温暖潮湿，食物丰富，你的朋友们带着他们闪亮的玩具来来往往。听起来像梦幻般的暑假也是现实的在体外细胞培养实验，也是污染物入侵的绝佳机会。实验室中的每个人、试剂和设备都是入侵微生物、不受欢迎的细胞和化学杂质的潜在载体，这可能会在实验研究和制造中造成昂贵的问题。细胞培养污染在很多层面上都是一个问题，对实验产生直接影响，对科学界产生更广泛的问题。

细胞培养污染的后果

污染物会影响所有细胞特性(如生长、代谢和形态)，导致实验结果不可靠或错误。细胞培养污染可能会产生重复实验的需求，导致令人沮丧的时间延迟和昂贵的试剂浪费。从未被检测到的污染培养液中获得的数据可能最终发表在科学期刊上，使其他人可以根据可疑的结果建立假设。交叉污染和错误识别细胞系的普遍性是一个长达数十年的问题;1967年，被认为来源于各种组织的细胞系被证明是海拉细胞，一种人宫颈腺癌细胞系。¹然而，在21世纪初，涉及这些被错误识别的细胞系的研究继续出现在数百篇引用中。²

这种模式是一个公认的问题，并有可能破坏科学的完整性。第一次发表撤回自然方法是因为细胞系污染吗^3.一项对2017年“污染”文献的保守估计发现，有32755篇文章报道了错误识别细胞的研究。⁴而许多科学家可能都是幸福地不知道在过去，人们对被错误识别的细胞系的认识正在增长。

决定如何最好地处理这些知识并不简单，而且已经被广泛讨论过。⁴为了防止进一步的数据污染，现在已经有了人类细胞来源和身份的认证证书要求由国际癌症杂志，并得到资助机构的鼓励。还有人质疑强制检测是否真的是最好的出路。^3.

但是对于现有的被污染的文献应该做些什么呢?大规模撤回受影响的文章可能会不成比例地惩罚少数科学家的职业生涯，并且可能是对包含潜在有价值数据的资源的浪费。最近提出的一种“自我收回”系统建议用赞扬来取代指责，以鼓励自我纠正。⁵事后以“表达关注”的形式给已发表的文章贴上标签，可以让现有的发现保持可访问性，同时让读者有机会形成自己的判断。

最后，细胞携带的病原体(有意或无意)或培养基成分中携带的病原体是潜在的健康危害，已经报告了实验室获得性病毒感染。^{6 - 8}事实上，当细胞被引入患者体内时，风险更高，这凸显了细胞治疗中质量控制的至关重要性。

避免细胞培养污染的提示

第一步 避免细胞培养污染 在于了解潜在的污染源，并采取措施降低这些污染源的污染风险。⁶

在被允许在组织培养设施工作之前，实验室人员应由有经验的工作人员对无菌细胞培养技术进行充分的实际培训。虽然每个实验室都有自己的标准操作程序，涉及到孵化器的使用，高压灭菌，培养物的标签，介质存储和废物处理，指南通常包括以下提示:⁹

● 在处理细胞前后要洗手或消毒

● 避免将培养物在培养箱外放置太长时间

● 清楚明确地标注所有文化

● 使用前和使用后对工作表面进行消毒

● 检查消毒剂是否有效，是否适合工作

● 每次只培养一个细胞

● 每个细胞株使用不同的培养基和试剂

● 隔离新的细胞株直到支原体检测呈阴性

● 避免过度使用和依赖抗生素

● 记录一个细胞系在培养基中培养了多长时间

实验室的设计也可以起到一定的作用;柜子应放置在远离交通通道、门和空调入口的地方。⁶限制区域进入，只允许必要的实验室人员进入，减少了微生物安全柜周围气流的干扰。

水浴，CO₂恒温箱、架子和水盘是常见的罪魁祸首，应定期清洗或高压灭菌，适当时使用化学消毒剂。其他感染途径包括意外溢出、与非无菌表面接触、移液或倾倒时溅回、微观气溶胶以及脊椎动物、灰尘和螨虫的感染。

研究小组分离干细胞使用独特的细胞特性来过滤掉不需要的细胞，徐美菊博士解释说，她是北京大学干细胞治疗博士后研究员莱比锡大学。徐博士指出:“间充质干细胞最重要的特征之一是在没有事先涂层的塑料表面上附着和生长。这一步可以通过去除上清液来消除非粘附细胞(例如血细胞)。”

瀑样研究员汉斯聪明来自乌得勒支大学Hubrecht发育生物学和干细胞研究所，通过使用单核苷酸多态性(SNP)基因分型评估细胞的遗传多样性。克利弗斯实验室最近从他们的哺乳动物细胞的工作中扩展到生产蛇毒腺类器官．Clevers博士指出:“我们已经意识到，类器官培养物的污染是一个严重的问题。我们观察到，常用的“快速生长”的类器官培养物会污染生长较慢的类器官培养物。典型的“快速生长”是在实验室中各种人类类器官培养物中出现的原始小鼠“迷你肠道”。我们对所有送来的人体样本进行snp鉴定，这样我们就能追踪一段时间内人体类器官培养物的纯度。廉价、快捷，是避免重大错误的关键。”

生物污染的种类和来源

细菌、霉菌和酵母是生物污染物，它们可以从无数的来源中显现出来，并且通常处于更“可检测”的一端。相比之下，被称为支原体的原核生物不能被肉眼或典型的光学显微镜检测到，而且它们足够小，可以通过用于消毒细胞培养基的过滤器。¹⁰支原体过去是通过受污染的胎牛血清和其他培养基添加剂到达的，现在这些来自有信誉来源的产品经过检查，是无污染的。现在，支原体被认为是从一种培养物分布到另一种培养物。¹¹支原体检测通常是外包的，因为需要引入阳性对照会给受影响的实验室带来风险。¹⁰

组织培养实验室在检测支原体存在时，推荐采用基于pcr的方法、间接染色、琼脂和肉汤培养的多种方法。¹⁰病毒可以起源于患者、宿主动物细胞源和动物源性培养基，虽然下一代测序可以帮助检测，¹²生物安全法旨在从一开始就防止有潜在危害的产品进口。

支原体事实:细胞培养实验室污染的危险

支原体是最常见的细胞培养污染物之一，六种支原体占所有污染物的95%。因此，提高我们对支原体污染的根源以及如何最好地预防支原体污染的理解是很重要的。下载此信息图以了解细胞培养实验室中支原体污染的更多信息。

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化学污染物的来源

细胞培养中存在的非活性成分被归类为“化学污染物”。化学污染物可能来自试剂和设备，甚至生物来源(例如自由基和内毒素)。有机化合物、内毒素和微量金属离子可能存在于未经充分净化的水中，而高度净化的水会随着时间的推移从玻璃器皿、管子和管道中抽出这些成分。¹³污染物可以在日常维护过程中引入，如蒸汽发生器。具有讽刺意味的是，化学消毒剂和洗涤剂会留下细胞毒性残留物- - - - - -瓶盖衬是常见的罪魁祸首。¹³过度暴露在荧光灯下会导致某些介质组分的光活化，从而使介质的质量逐渐恶化。¹⁴在“污染物”领域通常不考虑的其他因素包括温度、辐射、辐照和振动。

快速微生物检测，自动化，还有一个金问题

快速微生物检测技术正在开发中，以满足对细胞治疗产品的严格要求，这些产品的保质期短，可用于测试的样本量小。Hsu博士说:“传统的方法包括支原体基因PCR和DAPI染色，但后者不够敏感。现在有实时PCR试剂盒可用于检测细胞治疗产品的细菌污染。”

关闭生物反应器系统随着集成机器人技术的优化，将降低污染风险，受到即将到来的“向外扩展”而不是“向上扩展”趋势的青睐。^15日16

无论您的实验规模如何，在排除故障时要问的一个关键问题是“有什么新情况?”-这有助于识别污染物进入的可能路径。

在细胞培养污染的罪魁祸首自我介绍之前，你应该确切地知道你在寻找什么;仔细阅读指南向你们展示如何识别细胞培养的问题是一个很好的开始。

引用:

1. 加特勒，s.m.(1967)。在细胞培养中作为示踪剂的遗传标记。国家癌症研究所专著，26, 167 - 195。
2. 纳酮，r.m.(2008)。抑制猖獗的交叉污染和错误鉴定细胞系。生物学技术，45(3), 221 - 227。https://doi.org/10.2144/000112925
3. 伊万科，D.(2013)。由细胞系污染引起的收缩:自然方法．从检索http://blogs.nature.com/methagora/2013/09/retraction_resulting_from_cell_line_contamination.html
4. 霍巴赫，S. P. J. M. &哈尔夫曼，W.(2017)。海拉的幽灵:细胞系错误鉴定如何污染科学文献。《公共科学图书馆•综合》，12(10), e0186281。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186281
5. 法内利，D.(2016)。建立一个诚实错误的“自我收回”系统。自然，531(7595), 415 - 415。https://doi.org/10.1038/531415a
6. Geraghty, r.j, Capes-Davis, A.， Davis, j.m, down, J.， Freshney, r.i, Knezevic, I.， Lovell-Badge, R.， Masters, j.r.w, Meredith, J.， Stacey, g.n .， Thraves, P.， & Vias, M.(2014)。生物医学研究中使用细胞系的指南。英国癌症杂志，111(6), 1021 - 1046。https://doi.org/10.1038/bjc.2014.166
7. 汉默勒，K.，戴维森，W.，亨利，W.，拉博切塔，A. C.和鲁奇，H. G.(1959)。感染所致的脑脊髓炎疱疹病毒simiae(B型疱疹病毒):两例实验室获得性致命病例报告新英格兰医学杂志，261(2), 64 - 68。https://doi.org/10.1056/NEJM195907092610203
8. 科埃略，a.c， & García Díez, J.(2015)。生物风险和实验室获得性感染:卫生生物技术中不能忽视的现实。生物工程与生物技术前沿“，，3.．https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00056
9. 柯克，S.，鲍尔斯，M.，鲍，G.，戴维斯，J.，格斯特朗塞勒，G.，哈东，T.，海，R.，默滕，o.w.。(2005)。良好细胞培养规范指南:第二ECVAM良好细胞培养规范工作组报告。实验室动物的替代品，33(3), 261 - 287。https://doi.org/10.1177/026119290503300313
10. 杨，L.，宋，J.，史黛西，G.和马斯特斯，J. R.(2010)。支原体在细胞培养中的检测。自然的协议，5(5), 929 - 934。https://doi.org/10.1038/nprot.2010.43
11. McGarrity, g.j.(1976)。细胞培养支原体感染的传播与控制。在体外，12(9), 643 - 648。https://doi.org/10.1007/BF02797464
12. 理查兹，B.，曹，S.，普拉夫西奇，M.，庞波尼奥，R.，戴维斯，C.，马塔利亚诺，R.，马登，S.，克林格，K.，和巴勒莫，A.(2014)。利用新一代测序技术检测外来因子。医药科学与技术杂志，68(6), 651 - 660。https://doi.org/10.5731/pdajpst.2014.01025
13. 李国强，李国强(1998)。第四章细胞培养污染:来源、后果、预防和消除。在细胞生物学方法(第57卷，第49-65页)。爱思唯尔。https://doi.org/10.1016/s0091 - 679 x(08年)61571 - x
14. 王荣杰(1976)。室内荧光灯对组织培养基变质的影响。在体外，12(1), 19 - 22日。https://doi.org/10.1007/BF02832788
15. Kino-Oka, M.， Ogawa, N.， Umegaki, R.， & Taya, M.(2005)。用于连续培养依赖于固定的细胞的生物反应器设计。组织工程，11(3 - 4), 535 - 545。https://doi.org/10.1089/ten.2005.11.535
16. 温德，D.，里博尔迪，S. A.，乔菲，M.和马丁，I.(2009)。生物反应器在三维细胞培养和组织制造中的潜力和瓶颈。先进材料，21(32-33), 3352 - 3367。https://doi.org/10.1002/adma.200802748