冻结的新领域:低温贮藏的进步

低温贮藏,冻结住生物样品在零度以下,唤起场景科幻电影整个宇宙的长途旅行还是个人身患绝症的复活,在未来有一个可用的治疗方法。虽然同行的人显然仍然是科幻小说的领域,哺乳动物细胞培养,主细胞,组织,微生物,植物细胞行和种子,甚至整个有机体,如秀丽隐杆线虫蠕虫目前的或在低温贮藏的管道。同行整个哺乳动物器官虽然目前不可行,是一种积极和扩大面积研究为器官移植,可能增加可用性的材料。

除了一个广泛的范围可能biosamples低温贮藏,也有许多潜在的应用。低温贮藏是一个潜在的生殖医学技术在冻结卵母细胞和也被调查银行biosamples生物多样性和保护工作。在生物医学和生物学研究中,低温贮藏已经广泛应用于实验室支持珍贵,非商业细胞系和文化不积极使用存储在实验进行中。使技术更广泛使用,低温贮藏的研究做出重大进展克服固有的挑战冷冻细胞,组织和器官长期零度以下存储。

基本的挑战

“同行biosamples是一个复杂的过程有几个原因,”解释道乔纳森Lakey外科医学院名誉教授和亨利·萨姆厄工程学院加州大学欧文分校。“冻结诱发cryoinjury细胞损伤引起的细胞内冰晶的生长,这机械破坏细胞结构。此外,冻结导致局部细胞盐梯度变化,可能引发渗透压休克。这些损坏,cryoinjured细胞不太可能生存解冻后,阐述了Lakey击败低温贮藏的目的。”“当然,cryoinjury可以减少通过添加制冷剂冷冻保护剂,在冻结过程中物质,能保护细胞。另外,样品需要冷却速度最优,也有特异性的考虑,它必须确定经验设计最好的方法为特定的细胞或组织类型。例如,胰岛细胞和卵母细胞更好的快速冷却,而肝细胞和造血干细胞需要相对缓慢冷却。”

正是这些特异性因素呈现低温贮藏挑战比单细胞样品组装更复杂。“有两个关键原因同行组织和器官是困难的,”解释道藏红花科比,阀杆RMIT科学学院研究员,澳大利亚。“首先,组织和器官是由几个细胞类型的变量的大小,吸收冷冻保护剂和冻结在不同的利率。这些不同的质量和传热动力学需要不同的低温贮藏的协议细胞在相同的器官。第二,尽管一个重要组件的冷却介质,冷冻保护剂,它必须渗透细胞,帮助他们生存冻结,也通常对细胞毒性。冻结一个器官,所有层在多层组织和器官需要暴露在冷冻保护剂;然而,放置一个器官直接进入冷冻保护剂的增值税,如二甲亚砜(DMSO),目前的标准,使外层立即开始之前死于中毒冷冻保护剂可以渗透的核心器官。”

为临床应用保持酷:细胞冷冻保存

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两个比一个好

许多研究都集中在发展中更少的有毒或无毒的冷冻保护剂,最好是改善低温贮藏的成功。Lakey和他的研究小组调查相结合DMSO和乙二醇cryoprotect胰岛细胞,可以治疗患者1型糖尿病。“移植细胞的过程依然不佳,虽然埃德蒙顿协议达到相对比之前更好的移植物存活率的方法。移植受者接受免疫抑制疗法预防移植排斥,但这些移植细胞免疫抑制药物是有毒的,在解冻后脆弱的状态。然而,如果可以开发更好的低温贮藏方法,使细胞更可行的在融化,这可能提高他们的生存机会后移植和免疫抑制方案,”解释Lakey潜在的医疗程序。

添加DMSO的正常浓度的冷冻细胞逐步2 m .但相结合1 M DMSO 0.5乙二醇,Lakey和他的团队能够总所需的冷冻保护剂浓度下降,降低总体毒性冷冻保护剂的混合物。接下来,他们冻结了胰岛细胞DMSO-ethylene乙二醇冷冻保护剂混合物在2 M DMSO,复兴了细胞,并移植到糖尿病小鼠缺乏细胞。如果细胞移植是可行的,他们开始产生胰岛素,血糖调节分子,它返回糖尿病小鼠normoglycemia状态,意味着正常的血糖水平。“结果非常令人鼓舞,”Lakey召回工作。“我们发现糖尿病老鼠接受细胞冷冻DMSO-ethylene乙二醇混合物能够回到normoglycemia 12天比老鼠更早接受相同数量的细胞只冻结在DMSO溶液。这些发现表明,细胞更可行的在融化时一直cryoprotected DMSO-ethylene乙二醇比仅在DMSO溶液混合。继续改善低温贮藏的前景长期的β细胞银行”。

科比也调查了使用二元混合物,调用深低共熔溶剂,如冷冻保护剂。深低共熔溶剂形成的组件交互的复杂网络,叫做氢键,降低冰点的解决方案。此外,深低共熔溶剂“玻璃成型机”,这意味着他们形成一个非晶态固体冻结,而不是大幅晶体像水一样,呈现溶剂更损害细胞。“我们测试了六深低共熔溶剂同行哺乳动物细胞系。细胞被解冻,我们评估他们的健康使用原子力显微镜和共聚焦显微镜。我们确定了一个深低共熔溶剂毒性明显低于DMSO,”科比解释说她的研究中,第一个系统地测试这些类型的解决方案作为哺乳动物细胞冷冻保护剂。”候选人冷冻保护剂混合物比它更少的有毒成分,强调多组分的系统的好处。此外,由于深低共熔溶剂比DMSO溶液的毒性要小得多,细胞可以孵化数小时37°C没有大大降低他们的生存能力在复活。”

这样一个低毒性,低共熔溶剂可能有潜在应用冻结器官移植之前。不幸的是,目前,大量同意器官从死去的人不习惯移植。可用性的无毒的冷冻保护剂可以帮助解决这个问题通过冻结,直到他们需要移植器官,防止浪费捐赠的样本。“从理论上讲,孵化一个器官在我们深低共熔溶剂不会杀死细胞的外层。因此,你可以等待它渗透到更深的层次,这将改善的成功冻结一个器官well-permeated冷冻保护剂。这是我们正在研究大道。”

低温储存动物细胞培养

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封装保护

另一种方法Lakey和他的团队测试改善低温贮藏封装在一层海藻酸细胞吸水凝胶聚合物隔绝褐色海藻。“这个项目背后的基本原理是,海藻酸生物材料将作为保护层的胰岛β细胞,改变冷冻保护剂的动态渗透和减少毒性和曝光。海藻酸盐膜还可以保护细胞通过提供另一层材料把它们粘在一起,”阐述了Lakey。事实上,封装增强胰腺β-细胞解冻后生存和功能。当移植,细胞被封装在藻酸盐冻存前糖尿病老鼠回到normoglycemic状态近两周的速度比细胞没有封装之前冻结。“这肯定似乎是一种很有前途的方法,可以改善胰岛的低温贮藏协议,“Lakey结束。

冻结的未来?

当被问及未来方向,Lakey回答说,自定义协议需要为特定的细胞类型。“我加了很多在我的职业生涯中与细胞,具有潜在的医学应用1型糖尿病患者。然而,还有其他各种各样的细胞类型,如干细胞、免疫细胞,这可能是有用的治疗某些疾病。每个细胞都有不同的渗透动力学,因此需要一个定制cytoprotectant。通过降低cytoprotectant毒性,我们甚至可能达到组织和器官的冻结。”

科比也赞同这个观点,也认为更少的有毒cytoprotectants和定制的冻结协议可能会使机关冻结一天成为现实。“有两个关键方面,我认为将推动这一领域,”她说。“新冷冻保护剂,毒性更小,从而为更广泛的工作数量的细胞类型。同时,新技术更均匀的冷却和加热。例如,微波和磁技术正在接受调查的其他组织,以促进更好的冻融较大的样品,非常有前途。”科比自己也测试质子离子液体,就像深低共熔溶剂、玻璃成型机。“通过调整这些溶剂的特定属性,我们可以优化他们的同行各种类型的细胞,,希望有一天,器官。”