聚丙烯酰胺凝胶电泳，工作原理，技术变体及其应用

凝胶电泳是生物学学科实验室的一项基本技术，可以分离DNA、RNA和蛋白质等大分子。不同的分离介质和机制允许这些分子的子集通过利用它们的物理特性更有效地分离。特别是对于蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)通常是选择的技术。

在本文中，我们将讨论PAGE的工作原理、如何解释它以及它的一些应用程序。

什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳，什么是蛋白质电泳?

页面一种技术是根据大分子，如蛋白质，来分离它们电泳迁移率也就是说，分析物向带相反电荷的电极移动的能力。在PAGE中，这是由电荷、大小(分子量)和分子的形状决定的。分析物通过聚丙烯酰胺凝胶中形成的小孔移动。与DNA和RNA不同，蛋白质根据所含氨基酸的不同而不同，这可能会影响它们的运行方式。氨基酸链也可能形成二级结构，影响它们的表观大小，从而影响它们如何能够通过孔隙。因此，如果需要更准确的大小估计，有时可能需要在电泳之前变性蛋白质以线性化它们。

在聚丙烯酰胺中形成的孔隙比琼脂糖小，用于琼脂糖凝胶电泳．这使得它更适合于在大的多核苷酸DNA或RNA片段上分离蛋白质，并允许分离相对较小的蛋白质。因此，当人们提到“蛋白质电泳，他们最常提到的分离技术是PAGE。

SDS PAGE vs原生PAGE

PAGE可以在变性或非变性条件下运行，这取决于分析的目的。

阴离子洗涤剂，十二烷基硫酸钠(SDS)，结合热，有时还原剂被用来变性蛋白质在电泳分离之前，在一个过程中称为SDS页面．热破坏氢键,二级和三级结构而还原剂,如β巯基乙醇,二硫桥劈开。蛋白质被线性化并与SDS复合，因此所有蛋白质都具有相似的质荷比。这消除了结构和电荷的影响，蛋白质仅根据分子量的差异进行分离(图1)。该系统被开发出来¹通过Ulrich K. Laemmli通常用于分离5的蛋白质- - - - - -250 kDa。

图1: SDS PAGE中蛋白质的线性化。二硫键被β-巯基乙醇还原，而SDS抵消了质荷比的差异，因此蛋白质是根据分子量分离的。

在本机PAGE中，²这些键被完好无损地保留了蛋白质的高级结构。因此，蛋白质在凝胶中的分布主要受蛋白质电荷的影响(由其氨基酸序列和氨基酸序列决定)转录后修饰)和分离的pH值，而不是其大小(以kDa为单位)。然而，它允许研究人员分析天然或“原生”状态下的蛋白质。例如，在分析结合蛋白或复合物时，当重要的是它们的生物活性保持完整时，这可能是可取的。由于这里的目的是保持蛋白质的自然状态，在样品制备中不使用SDS、还原剂和加热，也可以使用较低的电压进行分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是如何工作的?

PAGE的基本原理是通过电流使其通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙来分离分析物。为了实现这一点，丙烯酰胺- - - - - -双丙烯酰胺混合物通过添加过硫酸铵(APS)聚合(聚丙烯酰胺)。该反应由四甲基乙二胺(TEMED)催化，形成网状结构，分析物可以通过孔隙移动(图2)。凝胶中总丙烯酰胺的百分比越高，孔隙尺寸越小，因此能够通过的蛋白质越小。丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例也会影响孔径大小，但这通常保持不变。较小的孔隙尺寸也降低了小蛋白质在凝胶中移动的速度，提高了它们的分辨率，并防止它们在电流施加时迅速跑到缓冲液中。

图2: 丙烯酰胺聚合与交联。在TEMED催化下，APS催化丙烯酰胺聚合交联。丙烯酰胺组分的总浓度和丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例影响凝胶的孔径大小，因此影响可以解决的蛋白质大小范围。

1.设备

不管PAGE凝胶的类型是什么，设备设置也是一样的．但是，如果您在运行SDS PAGE和原生PAGE之间切换，请确保所有设备都被彻底清洗，或者如果可能的话，为每种类型单独设置一套，以避免变性剂交叉污染到原生分析中。制作凝胶需要玻璃板、间隔片、梳子(用于创建样品孔)和铸造框架。间隔器和梳的大小取决于您希望运行的样品的体积和数量。重要的是，玻璃板在组装之前要彻底清洗和干燥，以防止凝胶质量差或倾倒凝胶时泄漏。未被去除的蛋白质残留物可能会在凝胶染色时损坏凝胶。

为了运行凝胶，还需要电泳罐、电源组和电泳架(通过凝胶的电流)。

2.缓冲区

PAGE需要三种类型的缓冲区:

• 凝胶铸造缓冲液(用于制作凝胶)
• 样品缓冲
• 运行缓冲液(填充电泳发生的凝胶池)

电泳可以利用连续或不连续缓冲系统。^3.一个连续缓冲系统只有一个缓冲液用于样品，凝胶和凝胶罐，很少用于蛋白质分析，因为分离倾向于扩散和低分辨率。一个不连续缓冲系统最常用于蛋白质分离，对凝胶和运行缓冲液使用不同的缓冲液。所使用的凝胶还包含两层(堆叠和分解凝胶)，具有不同的孔径和不同的缓冲成分。不连续缓冲系统倾向于产生更高分辨率的分离。

基于tris的缓冲区用于PAGE。三-甘氨酸、二-三、三乙酸和三三氨酸都添加了SDS，用于SDS PAGE，最常用的是三-甘氨酸。对于天然PAGE，最常用的是不含SDS的三硼酸乙二胺四乙酸(TBE)。pH值和离子强度的差异，以及凝胶百分比的差异，导致缓冲的不连续。

3.这种凝胶

蛋白质凝胶由两部分组成堆积凝胶和溶解凝胶．的角色叠加凝胶是允许样品加载和引导样品进入溶解凝胶的顶部，使它们同时进入。样品中的蛋白质将被分离，这样它们就可以在溶液中被“分解”解决凝胶．最佳凝胶百分比取决于要分离的蛋白质的大小。百分比越低，能通过的蛋白质就越多。较低百分比的凝胶(通常约为总丙烯酰胺的4%)用于堆叠凝胶，而不考虑分析物的大小，因为它不执行分离。与溶解凝胶相比，它的pH值通常较低(约为6.8，而不是8.8)，并且具有不同的离子含量，以帮助将样品分析物聚焦成一个紧密的带，从而进入溶解凝胶。分解凝胶的百分比取决于你想分离的蛋白质的大小，通常在7%到12%之间。也可以创建梯度凝胶，在样品进入的顶部有低百分比的聚丙烯酰胺，沿着样品的路径增加，以便可以分离更广泛的蛋白质大小。对于SDS PAGE，用于凝胶的缓冲液包括SDS，但对于原生PAGE则省略了这一点。

溶解凝胶首先倒在梳子的下方。加入聚合剂后，你需要在凝胶开始凝固前快速工作。凝胶应该在玻璃板之间移液，避免产生气泡，然后在上面倒上一层水合异丙醇(IPA)，使边缘更脆。一旦溶解凝胶凝固，倒出IPA，用水反复冲洗。现在应该将堆叠凝胶移到顶部，并将梳子放置到位，确保没有气泡。凝胶凝固后，可以立即使用，或在冰箱中储存在一个密封袋中，加入少量水，以避免脱水，直到需要时使用。它们可以成功地储存几天，甚至几周，但它们储存的时间越长，两个凝胶层之间就会发生更多的扩散，由此产生的分离可能会受到影响。

可以购买预制凝胶;然而，它们通常比你自己制作更贵。

4.样品制备

样品制备将根据您进行的是SDS PAGE实验还是原生PAGE实验而有所不同。

为SDS页面例如，溶解的细胞、组织或细菌等样品与含有许多重要成分的负载染料混合。一种染料，如溴酚蓝，允许样品在装载和运行期间被看到。甘油有助于减轻样品的重量，防止它在装载过程中浮出井外。SDS和β-巯基乙醇线性化存在的蛋白质，并否定电荷的差异。混合物加热到100度°C煎3分钟通常就足够了，这也有助于蛋白质变性。

为本地的页面负载染料中不包括SDS和β-巯基乙醇，也不进行加热步骤以保持蛋白质的天然构象。

在装入凝胶之前，将样品离心(16100 x g 2分钟就足够了)以去除不溶性碎片。只有上清液应该被装载，因为微粒会干扰样品在凝胶中的运行。

5.控制

大小标记通常包含在样本行的两端，以便对检测到的任何波段进行大小估计。在可能的情况下，应包括参考蛋白以及阳性和阴性对照，以验证未知样品中的观察结果。来自已知产生感兴趣蛋白或纯化靶蛋白的菌株或细胞的裂解液可提供合适的阳性对照。然而，与未知样本相同但已去除编码目标蛋白的基因的菌株或细胞系可提供合适的阴性对照。在检测非纯化蛋白质样本时，尽可能精确地模拟未知样本的控制方法尤其有用，因为它有助于将背景带与感兴趣的样本区分开。

6.运行凝胶

用适当的缓冲液部分填充电泳槽，通常为三甘氨酸-SDS用于SDS PAGE, TBE用于原生PAGE。

从铸造框架中取出凝胶(仍在玻璃板之间)并将其插入电泳框架中。小心地将其放入电泳槽，并加满运行缓冲液，使孔的顶部被淹没。在准备下凝胶之前，将梳子留在原位，这有助于保持井眼的完整性。取下梳子后，用非常细的移液管尖或针装载样品。注意不要损坏井的边缘或使其过载，否则样品可能在通道之间被交叉污染。负载染料与样品相结合有助于直观地指导这一过程，并将样品混合物拉入孔的底部。

把盖子放在水箱上，确保电极是正确的(黑色到黑色，红色到红色)，并对设置施加电流。所使用的电压和运行时间将根据所使用的溶解凝胶的百分比、分析物的大小以及正在运行的是SDS还是本地分析而变化。通常，200 V的35分钟是SDS PAGE的一个良好起点，100 V的40分钟是原生PAGE的起点(图3)。对原生PAGE的运行缓冲液进行预冷有助于防止样品升温，限制变性和损伤。

图3: PAGE中蛋白质电泳的样品制备。1)准备样品用于分析，2)铸造凝胶并准备设备，3)在凝胶罐中添加缓冲液并将样品/对照添加到凝胶中，4)对样品施加电流以分离蛋白质，5)对凝胶进行染色和可视化。

7.染色和可视化

一旦样品沿着凝胶迁移了足够的距离，这可以通过染料的前端位置看到，凝胶框架从容器中取出，凝胶小心地从玻璃板中取出。堆积凝胶已经完成了它的工作，可以小心地切断和丢弃，只留下溶解凝胶。

现在必须对蛋白质进行染色，通常使用考马斯亮蓝进行染色^4，5一种有机染料，与碱性氨基酸混合，染色蛋白质并固定在适当的位置。凝胶浸泡在通常由20% (v/v)甲醇、10% (v/v)冰醋酸和0.1% (w/v)考马斯亮蓝加水组成的染色溶液中。凝胶浸泡在污渍中约1小时(或直到充分染色)，轻轻搅拌(注意不要撕裂凝胶)。加热可以加快这一过程，但不要煮沸溶液。然后,洗掉多余的染色;你会注意到染料也会染色聚丙烯酰胺凝胶，尽管程度比蛋白质要小。因此，必须对凝胶进行染色。由于染料与蛋白质的结合比凝胶更紧密，因此可以使用与去除染料的染料相似的溶剂从凝胶中不含蛋白质的部分中去除染料。典型的脱色方法是在水中加入50% (v/v)甲醇和10% (v/v)醋酸。凝胶可以用温和的搅拌在脱色中过夜，以获得带有染色蛋白带的清晰背景，但与染色一样，可以通过加热加速脱色。 Gels are then rinsed in water and can be visualized immediately; they can be stored in a little water to prevent dehydration.

在不需要去污的情况下染色蛋白质的解决方案是可用的，如果需要快速得到结果，可以特别有用。然而，它们通常比标准染色方案更昂贵。其他污渍，比如银染色，⁶也可用于特定目的，但考马斯染色是最常见的。

解读蛋白质凝胶

由于PAGE凝胶通常用考马斯亮蓝染色进行检测，因此与琼脂糖DNA凝胶不同，它们可以用肉眼观察和检查。可以用相机捕捉图像，以提供长期记录。标记梯子通常与蛋白质样本一起运行，以便估计它们的大小(通常以kDa为单位)(图4)。注意哪个样本被加载到哪个通道，以便准确地解释结果是很重要的。在天然PAGE凝胶中，由于二级结构影响其通过凝胶，尺寸可能不准确。在这些情况下，可以包括参考蛋白，以让用户了解他们的目标可能如何以及在哪里出现。当比较同一凝胶上的样品时，例如，使用不同的处理、条件或结合伙伴，以寻找差异时，Native PAGE也非常有用。条带的强度可以表明蛋白质的存在量，蛋白质越多，条带越强。如果加载了太多的样品，条带可能会呈现为难以或不可能解释的强烈的黑色涂片。在这些情况下，你应该考虑用较少的样本重复分析。

图4: Taq DNA聚合酶SDS PAGE。SDS - PAGE是一种根据电泳迁移率分离蛋白质的有效技术。标记(左手lane)是精度+蛋白质标准蓝色。采用SDS - PAGE法测定Taq DNA聚合酶的分子量。图片来源:Marta Ferreira，转载于Creative Commons Attribution 2.5 Generic许可证,创作共用属性相似共享3.0未移植许可证和GNU免费文档许可证。

什么是二维凝胶电泳?

有时，单一维度的蛋白质分离不足以解析相似的物种。在这种情况下，二维分离可以增加所需的分辨率，因为两个分子不太可能在两个不同的性质上非常相似。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，或2D PAGE，是由Joachim Klose在1975年同时提出的⁷还有帕特里克·h·奥法雷尔。⁸

在第一维中，蛋白质根据它们的大小线性地分开等电点(这与它们的电荷和pH有关)。在二维空间中，分子在90度处分离°按分子质量进行第一次分离，得到电泳图(图5)。

图5: 2D PAGE示例。水平分离蛋白(x轴)按等电点，垂直分离蛋白(y轴)按分子量。该样本来自生长有致病真菌的黄瓜植株。图片来源:Michal Sharo提供，Itayba，转载于创作共用属性相似共享3.0未移植许可证和GNU免费文档许可证。

蛋白质电泳的应用

PAGE用于从分子生物学和法医学到生物化学和基因组学的许多生物学学科，提供了重要的分析和诊断工具。让我们考虑一些PAGE是重要组件的技术。

蛋白质分析

通过PAGE直接检测样品可以提供一些有用的指标，包括:

• 如果存在预期的蛋白质
• 它的大小(或表面大小)是多少
• 大概有多少
• 蛋白质样本是多么纯正啊
• 是否已成功裂解(例如，从标签中)
• 蛋白质存在于哪个部分(例如，来自细胞裂解物部分)
• 蛋白质溶解度

在生产重组蛋白时，⁹重要的是能够检查感兴趣的蛋白质在纯化过程的多个阶段没有丢失，并且它出现在预期的大小。根据它所存在的部分，它还可以表明蛋白质溶解性是否存在问题，这可能会影响其功能或结合能力，或排除其在所使用的条件下的纯化。在净化过程结束时出现的多余条带也可以表明污染物的存在。重组蛋白是疫苗和生物制药开发以及诊断分析和研究的关键。

蛋白质分析对许多学科也很重要，包括食品和饮料开发，¹⁰质量控制、¹¹安全^12，13欺诈检测¹⁴和环境样品的分析。^15，16然而，随着技术的进步，这些领域的一些分析正在被取代¹⁷通过技术，比如质谱法．

电泳迁移率漂移测定

电泳迁移率漂移分析(EMSAs)是鉴定核酸的重要实验工具- - - - - -蛋白质复合物。这有助于识别诸如转录因子使用的结合位点。¹⁸而琼脂糖凝胶经常被用来实现这一点，因为它们允许更大的DNA更容易迁移- - - - - -蛋白质复合物，PAGE可以提供更大的分离分辨率和一些复合物更大的稳定性。¹⁹

免疫印迹

样品蛋白质的分离是任何免疫印迹实验和PAGE是实现这一目标的典型技术。当PAGE凝胶被吸到膜上进行印迹时，重复的PAGE凝胶也可以用考马斯亮蓝染色，以作为解释western blot结果的负载对照。这些可用于诊断感染性和非感染性疾病，评估治疗干预措施的疗效，为基础研究提供信息，检查重组蛋白纯化^20.并为组学研究提供功能性或有效性的信息。

质谱提取

一旦分离，凝胶带中的蛋白质可以被切除和纯化用于进一步分析。比如女士可用于获得关于样品中蛋白质的深入信息。

尿蛋白电泳和免疫固定电泳

PAGE可以提供一种有用的诊断工具来检测体液(如尿液或血液)中某些蛋白质的含量。琼脂糖凝胶电泳而且毛细管电泳也可以作为这些分析的替代方法。

通常情况下，尿液中应该没有或只有很少的蛋白质尿蛋白电泳(UPEP)检查通常测量白蛋白和球蛋白，可作为病理变化的指标。尿液中蛋白质含量高可能是多种疾病的指标，包括炎症、肾脏疾病、^21，22感染和某些类型的癌症(如骨髓瘤)²³并有助于指导进一步的调查或治疗。

白蛋白和免疫球蛋白²⁴也可以分析血清样本(血清蛋白电泳)来诊断一系列疾病，包括多发性骨髓瘤等癌症，²⁵淋巴瘤和白血病，肾脏疾病，肝脏疾病，营养不良，以及一些神经和自身免疫疾病。

Immunofixation²⁶可以在这些测试中用于识别蛋白质的某些亚型，例如免疫球蛋白a (IgA) lambda²⁷或M蛋白的重链和轻链类型。^28，29

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