突破极限:亚细胞和高通量细胞成像

长期以来，显微镜一直帮助科学家深入微观世界，对组织、细胞及其细胞器进行成像。在17年^th世纪,安东尼·范·列文虎克显著改进了简易显微镜，通过细胞成像发现微生物和显微结构。从那时起，他在显微镜学方面的开创性工作和对微生物学的贡献而闻名，这是由同名微生物学杂志所表彰的安东尼·范·列文虎克．显微镜不断发展，有了更高质量的镜头，可以捕捉更清晰的图像，更大的放大倍率，和不同的照明源，以更好地成像组织和细胞。技术进步，如超分辨率显微镜，使分辨率超过了可见光的衍射极限，有助于组织和细胞图像的更多细节。今天，所有的生物实验室都有显微镜，从基本的学校实验室到先进的研究设施。创新甚至使廉价的可折叠的显微镜能够成像细胞的。

细胞成像是基础和生物医学研究的支柱，通过几种实验技术，如殖民地、移民、入侵,细胞周期动力学和谱系化验。免疫细胞和免疫组织化学利用抗体标记分别对细胞和组织中的特定靶蛋白进行图像定位。或者，细胞可以通过发射过表达的荧光蛋白成像。显微镜上增加了一个成像室来调节温度、湿度和大气成分，从而实现了延时，live-cell成像研究动态过程，如囊泡形成，人口贩卖,和信息交互。

细胞成像领域已经走过了漫长的道路，并继续发展。亚细胞细胞器和单分子跟踪正在成为细胞成像技术的一个令人兴奋的途径。此外，就像许多领域在自动化和大规模实验方面经历了大规模的增长一样，多路复用和高通量细胞成像也同样首次亮相。

仔细观察:亚细胞细胞器和分子结构

随着显微镜的改进，它们的分辨率和成像细胞亚结构的能力也在提高，甚至可以精确到单分子水平。研究人员现在可以研究维持细胞生命的细胞器、货物和生物分子的精心安排的运输和相互作用。例子在更大的范围内 货物 沿神经元传输 mitochondrial-lipid滴 相互作用，到更小尺度的细胞内可视化 蛋白质 动态和新生 信使核糖核酸 单分子成像合成。

“高分辨率单分子显微镜技术的进步为我们提供了跟踪和计数成像细胞中的单个事件的机会。我们可以分析细胞器的分布和货物运输，而不仅仅是整个整体。这使我们能够辨别细胞运输和相互作用事件中存在的任何异质性，”教授解释说 Kai张 他在伊利诺伊大学香槟分校生物化学系、神经科学项目和生物物理学与定量生物学中心工作。张教授是一位资深的成像专家，他的科学生涯始于物理化学和光物理，制造显微镜。随着他事业的发展，他被神经科学所吸引，专注于神经元轴突的贩卖。他利用活细胞成像技术研究神经营养因子的转运，如神经生长因子( 神经生长因子 )和脑源性神经营养因子( 脑源性神经营养因子 )，以及使用超分辨率成像来描绘轴突轨迹本身，该研究的研究人员 微管 ．

“在神经元中，我们可以把轴突想象成高速公路，从一端到另一端的货物就像交通工具。神经元协调货物运输是至关重要的，这样必要的分子，如生长因子，就能到达需要它们的地方，例如生长的神经突。持续有效的货物运输确保了神经元的生存。”“不幸的是，在神经退行性疾病等疾病状态下，高速公路被破坏，这就形成了路障。我最早的一篇论文用活细胞成像来观察 线粒体转运缺陷 在神经元轴突中。我们在线粒体中表达了红色荧光蛋白，并能够单独追踪它们。我们发现，阿尔茨海默病(AD)肽，淀粉样蛋白β，损害了顺行线粒体运输(即从神经元体运输)，这是通过减少tau的表达来挽救的，tau是另一种关键的AD蛋白。有趣的是，在其他类型的神经疾病中，比如 Charcot-Marie-Tooth 2B型神经病 ，小GTPase Rab7的轴突转运可能会加速，这可能导致NGF携带的生存信号过早降解。这些研究证明了细胞成像如何有助于深入了解疾病病理，”张教授继续他的工作。事实上，细胞成像在研究发育中的细胞器和生物分子动力学方面有许多应用，例如， X染色体失活 ，以及疾病，例如， 癌症中的rna ， 糖尿病中的线粒体转运 ，以及贩卖 错误折叠的蛋白质 或 神经退行性疾病 ．

“既然我们知道交通在疾病中有缺陷，我们能拯救它吗?”我们能切换交通工具的开关并研究其影响吗?”张教授为他的一个研究任务设计了框架。” Optogenetic控制 细胞是我实验室的主要成就之一。在这项技术中，我们在细胞中表达一种光响应通道或蛋白质，我们可以通过照明激活它们。通过控制光线照射的时间和地点，我们可以在实验中进行时间和空间控制，并对细胞反应进行成像。”张教授和他的团队已经对细胞中的影响进行了成像 optogenetic 的监管 受体酪氨酸激酶 而且 英国皇家空军 对细胞的分化、调节 蛋白质的活动 , 细胞器和分子马达 分布。“我们现在正在推进这项技术在活的有机体内张教授讨论了他的实验室最近的一些项目。“通过调制 激酶 ，我们可以影响 脊椎动物的发展 的非洲爪蟾蜍光滑的在细胞分化和移动时成像原位在他们的微环境中。”将这项技术应用于小鼠也在张教授的研究范围内，尽管对更大的、不透明的生物体进行成像存在技术障碍在活的有机体内．“有可能使用光纤、可生物降解的植入发光设备或上转换纳米颗粒。我们正在调查这些可能性。”

小细胞，大的高通量技术

生成大型数据集的自动化、大规模方法是许多科学领域最近出现的趋势。细胞成像也不例外，最近已经开发了许多高通量技术。自动化流程，例如 深度学习 ，将计算图像分析和挖掘方法应用于成像细胞或组织 细胞分类 ，提高吞吐量。 整片成像 组织和细胞的，可以导致临床应用自动化组织病理学分类肿瘤，如 肺 癌症及其突变， 食管 腺癌，或者乳腺癌 淋巴结转移 ．

另一个令人兴奋的高通量途径是 成像细胞细胞术 (IFC)，这是一种流式细胞术的改编，结合成像。” 国际金融公司 是一个真正强大的技术，结合了“最好的两个世界”。它得益于显微镜的单细胞成像能力以及传统流式细胞术的高通量能力，”教授解释道 Yu-Hwa瞧 他是加州大学圣地亚哥分校电子与计算机工程系的教授。“传统 流式细胞术 分析感兴趣的蛋白质的细胞群，这是通过结合荧光标记抗体或内源性荧光蛋白表达检测。对于每个被分析的细胞，流式细胞术只确定感兴趣的蛋白质是否存在。 国际金融公司 通过增加成像检测方式来扩展功能，它提供了分析细胞中感兴趣的蛋白质的细胞内空间分布。”这种增加的空间维度有许多有用的应用。在研究中，IFC可以用于 细胞形态分类 ， 和信息 相互作用, 抗原表达 ， 细胞外囊泡 的表征和细胞内分析 病原体 等等。国际金融公司也有临床 诊断 应用，例如用于评估 急性白血病 ，细胞损伤 辐射 (biodosimetry), 红色的 分析(如红细胞成熟、镰状细胞、疟疾等传染病)。

目前，成像流式细胞仪只产生细胞的2维(2D)图像，尽管成像在 3 d 是一个涌现主题。“这是目前国际金融公司的一个劣势，因为2D图像包含的信息远远少于3D图像，”Lo教授解释说。“2D和3D细胞图像的一个类比是x射线图像和CT(计算机断层扫描)扫描之间的区别。x光是所有器官在一张图像上的净2D投影，所以器官重叠的地方信息会丢失，可能会隐藏重要的解剖特征。相比之下，3D CT扫描通过对人体进行连续切片成像，将器官彼此分开，并提供图像深度，从而包含更多信息。”国际金融公司面临的另一个挑战是能力有限 实时排序 的 细胞成像 ，其方式类似于传统流式细胞术中的荧光激活细胞分选(FACS)。“IFC产生了非常大量的数据，很难进行实时计算处理，这限制了我们对细胞进行实时排序的能力，”罗教授讨论了IFC的另一个弱点。“然而，排序能力将产生许多潜在的研究途径。分选为这些分离细胞的下游分子分析提供了独特的能力，将细胞表型特征与其分子和遗传特征联系起来。”

因此，为了进一步推动IFC的发展，罗教授和他的团队正在开发一种3D图像激活细胞分拣器。“我们需要能够对细胞进行3D成像，并对它们进行排序，以便进行下游分析。3D细胞成像产生的高信息量将改善细胞分类和细胞类型发现，更好地解决蛋白质定位，促进细胞周期研究，细胞-细胞相互作用，细胞标记物发现等 细胞对药物的反应 、毒素、环境压力等。其中一些应用可以通过深度学习和人工智能大大增强。此外，根据3D图像分离细胞的能力将是该系统的一个重大飞跃，使下游分析成为可能。”罗教授对他正在开发的3D图像激活细胞分选器感到非常兴奋，但他也意识到他需要克服一些障碍。“首先，对于高质量的3D图像，我们需要提高图像分辨率。其次，为了处理大量生成的数据，我们需要提高数据处理速度，以便仪器能够对细胞成像，并实时决定如何对其排序。我们在这两个方面都非常努力，希望能够实现3D图像激活细胞分拣机。”

“这是一个非常迷人的多学科领域，是生物物理学家、材料工程师和生物学家的合作，”张教授这样描述细胞成像领域。“当你把所有这些领域的专业知识结合在一起时，你就会取得重大进展，解开细胞的秘密。”