qPCR分析、qPCR机是如何工作的和qPCR协议

qPCR是什么?

qPCR选择性扩增技术和定量检测的DNA区域或互补DNA(互补)。寡核苷酸引物在一个感兴趣的区域是用来放大序列利用DNA聚合酶。¹放大过程的重复循环导致指数的副本数量扩张的目标区域跟踪置入使用染料或sequence-specific探针的荧光被发现在qPCR机和策划输出图。

qPCR和RT-qPCR之间的区别是什么?

RT-qPCR代表定量逆转录聚合酶链反应,“RT”不被误认为是“实时”。²与qPCR使用DNA模板,RT-qPCR的起始物料是RNA。³因此,协议将把RNA逆转录一步cDNA之前正常qPCR放大的过程就开始了。这可能是做了所有在一个反应管(一步法)或顺序与反转录发生在一个单独的反应qPCR放大(两步)(图1)。

图1: 图展示了一步法和两步RT-qPCR之间的区别。

qPCR机器是如何工作的呢?

像一个标准的PCR机器,qPCR机器由一个加热块和盖子之间促进样品的快速转变的温度,使放大DNA或互补脱氧核糖核酸模板(图2)。然而,qPCR机还集成了一个荧光源和荧光计激发荧光团和检测的荧光输出期间生成周期qPCR放大(图3)。机器通常或与电脑记录荧光计的输出和使用软件来解释实验结果基于用户定义的信息,如控制井和标准。

图2: 插图的PCR和qPCR放大过程。qPCR协议通常包含30左右 - - - - - - 40放大周期,每次复制数字翻了一番。

图3: 荧光信号生成dye-based和probe-based qPCR化验。

qPCR协议的例子

qPCR反应包含:

• DNA或互补,为放大提供了模板
• Sequence-specific引物,结合,形成新的副本的目标区域的基础
• DNA聚合酶-包含免费基地到新的扩增子
• Deoxynucleoside三磷酸腺苷(核苷酸)-核苷酸新的DNA链的构建块
• 探针或染料,使检测目标放大
• 缓冲区,优化反应条件

在许多情况下,预先混合的解决方案是使用包含聚合酶,核苷酸,缓冲区和染料(如果适用)。

1)掌握混合包含所有反应组件模板除了轻轻混合和整除反应管(通常是一个96孔板)。的模板(或水在没有模板的情况下控制——见“qPCR控制”),然后小心翼翼地添加到相关井和板或管密封。建议在重复或运行样本一式三份,如果可能的话,以提高结果的可靠性。

被动参考染料(如火箭)都包括在许多预先掌握混合。他们提供了一个内部参考的记者染料信号可以规范化在数据分析过程中,纠正对浓度或体积的变化。这些可以省略,定量不是必需的。

2)信息关于内容和位置,所使用染料或探针化学,任何标准或控件包括和循环条件提供给计算机用户/控制单元。

3)模板DNA或cDNA加热,导致变性和生产单链DNA (ssDNA)(图2)。绑定也插层染料(如果存在)分离出来,回到基态。

4)Sequence-specific引物结合目标序列(退火)和赠送的基地被添加到序列产生一个免费拷贝DNA聚合酶(引物延伸)。在这个过程中,测定的荧光团吸收一个波长的光并回送在较长,较低的能量波长如果它是不灭的。激发和发射的波长取决于荧光团(s)使用。

——的情况dye-based协议置入,染料将绑定新成立的dsDNA,当它发光。

——有许多不同probe-based然而,化学反应,他们通常工作在一个类似的原则。某种形式的荧光猝灭可以确保荧光只发生在目标序列存在,导致发光在放大。

5)然后产生的荧光检测到荧光计和由计算机记录。probe-based试验,因此荧光信号的数量成正比ssDNA片段被放大互补的探针,与dye-based化验双链的数量成正比(dsDNA)副本。

6)一旦完成放大,融化曲线分析可能在执行插入dye-based试验产品评估的离解特性dsDNA产品。插层染料,荧光将减少dsDNA链分离。50%的DNA变性时的温度称为熔化温度并将影响的序列qPCR产品。样品逐步加热,通常在一个范围从65年°C - 95°C,对荧光的影响记录。融化曲线分析可以帮助区分不相干的放大。这种方法不能用于probe-based化验,荧光在放大过程中产生。post-amplification调查可能的使用,然而,促进扩增子分化使用融化曲线分析,甚至可以检测单基地变化。^4,5

如何设计引物qPCR吗

许多相同的规则设计PCR引物也适用于qPCR引物,如:

• 引物设计成对(一个正向链和一个反向),特别是侧面目标区域
• 引物序列必须选择感兴趣的目标的独特序列,避免非目标绑定相似序列
• 引物应该有类似的融化温度(理想情况下60- - - - - -64年°C),使有效放大。这是影响比例的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)相比,腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)与高GC含量增加熔化温度。调整引物长度可以帮助在底漆对地址不匹配
• 两个引物的退火温度应该是相似的,不超过5°C以下引物熔化温度,以避免非特异性扩增。同样,这是影响引物长度和组成
• 目标,在可能的情况下,使用G和C的引物末端形式(三)债券比或T(双),提高引物结合
• 引物序列,如果可能的话,避免地区可能二聚或形成二级结构。这可以评估使用免费的引物设计工具
• 引物应该大约15- - - - - -30 bp的长度

然而,也有一些差异:

• 扩增子通常较小(80- - - - - -比标准PCR 150个基点)
• 必须没有不相干的放大,这将使量化,特别是对于dye-based化验

Dye-based qPCR (SYBR绿色qPCR)和调查

染料

在dye-based qPCR,置入一个染料用于显示弱荧光的释放形式,提高荧光信号强时绑定到dsDNA SYBR(图3)®绿色⁶是一种最常用的染料dsDNA绑定。^7,8荧光成正比dsDNA礼物的数量,使原来的模板数量计算。

插层染料不sequence-specific所以不需要根据个人分析,简化试验设计。这也使得他们更便宜。然而,这意味着他们会发出荧光,以应对日常的放大或非特异性产物以及期望的目标,降低特异性。融化曲线分析可以帮助这里的设施,特别是在评估新的化验。染料不能用于多路复用的反应,与探测器不同,不能分化的信号。因此,必须设置多个反应井单独底漆集来评估不同的目标。

探针

有许多不同类型的荧光探针和引物化学qPCR,但大多数依赖于某种形式的共价结合荧光冷却器分子释放的一个特定的目标序列。

置入与染料,探针sequence-specific所以必须为每个试验设计,增加试验设置的复杂性和成本。这不过意味着他们也提高检测的特异性。不同的探针可以使用不同的荧光体发射不同波长的荧光,所以他们可以提供多路选择兼容探测和机器拥有所需的过滤器。虽然最初的试验开发时间可能更长、更复杂,多路复用可以减少后续设置时间和试剂使用通过运行多个测试在一个。

常见的荧光探针包括:

水解探针⁹-也被称为TaqMan或5 '核酸酶,水解探针包括sequence-specific荧光标记寡核苷酸探针荧光记者一端和冷却器。完好无损,淬火时抑制荧光信号。5 ' 3’核酸外切酶活动的某些聚合酶裂解调查期间目标放大,所以附近的荧光记者不再是饮料,导致荧光信号(图4)。

这是其中一个最常用的探测器类型。

图4: 图展示了水解探测功能。荧光记者(右)所示绿色和冷却器(Q)的紫色,灰色目标DNA,放大在黄色(粗实线重量)和引物序列用黄色(细线)。

分子信标¹⁰——就像水解探针分子信标sequence-specific荧光标记寡核苷酸探针。然而,他们有免费基地(五、六)末端附近形成一个发夹结构,使淬火接近记者和淬火的信号。探针结合目标序列时,干色,将记者和冷却器,导致信号(图5)。由于它们的结构,分子信标探针比水解更难设计调查。

图5: 图展示了分子信标的功能。荧光记者(右)所示绿色和冷却器(Q)的紫色,目标DNA的灰色和黄色的底漆。

双杂交探针¹¹-也被称为LightCycler或烦恼探针,这种技术使用一对探测器设计结合相邻序列,用一双施主和受主染料标记,荧光共振能量转移(FRET)。探针结合目标序列时,供体和受体染料进入附近,担心发生和受体发出荧光(图6)。

图6: 图显示双杂交探针的功能。供体荧光团(R1)所示粉红色和受体荧光团(R2)绿色目标DNA的灰色和黄色的底漆。

小沟粘合剂(MGB)调查¹²-也被称为Eclipse调查,他们有一个荧光团和冷却器等两端水解调查。然而,他们也有一个附近的MGB冷却器。在没有目标的情况下,随机MGB探针线圈,将荧光团,冷却器进近。当探针结合其目标,辅助MGB,探测器线性,使发光的荧光团(图7)。

图7: 图展示了MGB探针函数。荧光记者(右)所示绿色和冷却器(Q)的紫色,橙色的MGB目标DNA的灰色和黄色的底漆。

Amplifluor化验¹³——在这里,被称为“探针”UniPrimer。UniPrimer有荧光记者一端和冷却器,形成一个发夹环在释放状态,淬灭了信号。在第一轮扩增,一对与目标相关的引物(称为Z底漆)免疫印迹和扩展来创建一个产品。在第二轮,另一个引物对高度的新成立的产品和扩展来创建第二个链。这作为一个模板的UniPrimer结合Z引物序列。扩展导致UniPrimer展开,释放荧光团从淬火(图8)。

图8: 图展示了Amplifluor化验工作。荧光记者(右)所示绿色和冷却器(Q)的紫色,灰色目标DNA,放大在暗黄色和引物序列与Z底漆黄色,黑色,表示。

蝎子探针¹⁴——在这里,其中一个引物作为探针。荧光记者和冷却器在对立的两端,形成茎环结构,淬灭了信号时不绑定到目标。一段序列互补的区域内下游引物结合位点和扩增子是包含在循环。在放大,这个区域与目标结合,导致循环地打开,释放出荧光记者从淬火的影响(图9)。

图9: 图展示了蝎子探测功能。荧光记者(右)所示绿色和冷却器(Q)的紫色,灰色目标DNA,放大序列黄色(重量线),在橙色和引物PCR阻滞剂黄色(细线)。

Light-upon-extension(勒克斯)调查¹⁵——再一次,其中一个引物与LUX-based化验也作为探针,然而,不像蝎子,没有饮料。勒克斯底漆有记者一端和采用一个发夹结构,本身淬灭荧光团的信号。当引物结合它的目标,它成为线性化,unquenching记者和产生荧光信号(图10)。

图10: 图显示勒克斯探测功能。绿色荧光记者(右)所示,目标DNA的灰色,放大序列在黑暗的黄色和淡黄色的底漆。

QZyme探针¹⁶——一个衬底融入QZyme化验,包含一个记者和冷却器维护在附近。的反义序列的引物结合催化DNA区域能够打通衬底。这个地区一旦放大,然后裂解底物,分离荧光团的冷却器和产生荧光信号(图11)。

图11: 图显示QZyme探测功能。荧光记者(右)所示绿色和冷却器(Q)的紫色,灰色目标DNA,放大在暗黄色和淡黄色的引物序列互补催化地区粉红色和黄色的。

锁核酸探针(LocNA)¹⁷——修改LocNAs核苷酸,包含一个亚甲基桥,限制结构的灵活性(图12)。合并LocNAs内探针序列可以提高特异性和促进短qPCR探测器的使用,有助于挑战序列。

图12: 一个锁核酸单体。修改基地包含一个亚甲基桥键(红色)2′氧气和4′之间的戊糖环的碳。

qPCR控制

包括适当的控制是很重要的^18,19在实验的设置,使解释结果和识别潜在的问题。这些包括没有模板控制(NTC),消极的控制和积极控制。

全国过渡委员会应该包含所有其他井,但是使用PCR的试剂级水的一个示例。这些井应显示没有放大,否则它是表明DNA / RNA的一个或多个试剂污染,或使用的设备设置实验。

负控制包含DNA / RNA,缺乏针对性的引物和探针。理想情况下,这将是一样的样品通过其他方式,所以应变/同一物种的个体缺乏感兴趣的基因(自然或通过基因操作)将是最优的。顾名思义,消极的控制应显示没有放大。取决于良好的分析是,它可能会得到非目标放大应该在dye-based化验可微的熔化曲线数据。如果这发生在常规化验使用,选择一个替代目标序列可能是可取的。

积极的控制^20.应该包含目标序列和已知放大成功(在一个既定的情况下分析),因为这是未知的信号将被比较。如果试验是在开发,确认数据,这是一个积极的示例与其他技术(如常规PCR,下一代测序(门店)或文化)可以帮助确认结果。如果积极控制无法放大,然后从运行的结果应被视为无效,因为它表明问题分析。

化验的目的来衡量相对定量而不是绝对定量,一样在一些转录的研究中,一个内生控制²¹要求应该是测量井。为此,应该转录的基因选择在一个常数,丰富的水平在所有样本在所有条件下,如看家基因。然后用于规范化数据感兴趣的基因的转录纠正等因素变化的起始物料和反应效率。

qPCR分析 - - - - - - Ct值,qPCR融化曲线和qPCR标准曲线

有很多方面是重要的知道在理解qPCR输出。

基线:背景荧光信号,通常确定周期早期检测之前增加荧光。

Rn(规范化的记者):荧光记者的荧光发射强度除以被动参考染料的荧光发射强度。

Rn -:Rn un-reacted值样本,从早期的周期或一个过渡委员会。

Rn +:包含所有反应的Rn价值组件,包括模板。

ΔRn:信号生成的大小由qPCR实验。

RnΔRn = (+) - (Rn)

阈值:阈值(常被视为一条水平线的放大图)是早期的平均标准偏差Rn周期,乘以一个可调节的因素往往取决于机器的软件。它代表一个显著点以上计算基准和应设置在该地区与PCR产品的一个指数增加。

Ct(阈值周期):这是所产生的荧光的周期数以及穿过阈值时足够的扩增子积累了。这有时也称为量化周期(Cq)、交叉点(Cp)或分支点(前)。

许多软件包将为您设置必要的分析参数;然而,它有助于理解它们的意思,如何调整,学会识别潜在的问题可能会影响结果。

输出从qPCR获得实验将部分取决于类型的分析来看,但应该获得一个放大图。这显示荧光信号的大小(ΔRn)生成轴绘制x轴上的放大周期为每个(图13)。包括复制相同的样本,他们应该尽可能的接近。变化之间的复制可能表明需要实验误差和重复。同样,重要的是,没有放大观察到全国过渡委员会或消极的控制和良好的积极信号是在积极的控制(s)。早期的周期数放大线穿过阈值,目标越高拷贝数的。

图13: qPCR放大图例子,这个例子展示了一组标准在重复运行。白线表示阈值。

如果这个实验的目的是确定是否存在一个目标和量化并不是必须的,然后标准不包括。许多qPCR包包括软件,会自动调用这样的积极或消极的结果。

当需要量化时,主要有两种选择,绝对定量和相对定量。为绝对定量,²²标准包括使确定目标拷贝数在一个未知的样本。标准使用同一物种的DNA用于未知(通常是一样的积极控制)和应包括各种浓度试验(它的完整功能动态范围),通常在连续稀释10倍,例如,1 x 10¹1 x 10²1 x 10³1 x 10⁴1 x 10⁵1 x 10⁶和1 x 10⁷每口井的DNA基因组拷贝。量化的样本,超出这个范围将不可靠,因此建议调整未知样本稀释成这个范围和重复测试。由此,可以推断未知的样本数量。的DNA拷贝数每µl可以计算出标准提供了用户知道股票的浓度DNA样本被用于制造标准和基因组的大小碱基对。一旦已经确定,可以进行适当的稀释。

开始的日志数量(平方米)策划的Ct值为每个标准井和一个最适合线绘制通过数据点(图14)。斜率表示效率(E)的分析,应该(也就是100%。,for each cycle the amount of product doubles).

E = 1 + 10^{(1 /坡)}

化验应该瞄准一个效率在110%到90之间,对应于一个斜率为-3.58到-3.10。的R²值标准曲线的相关系数得到,指示一个值是在预测另一多好,应该尽可能接近1,至少> 0.99。

图14: qPCR标准曲线的例子。

为相对定量,归一化称为 ΔΔCt使用。在这里,每个看家基因的Ct值(s)选择比较的Ct值感兴趣的基因(s)。这些规范化值之间比较控制和未知的样本。通过这种方法,不需要标准,减少试剂使用。然而,更大的工作需要在开发过程中,重要的是要注意,这种方法假设所有目标的放大效率接近100%,在5%。

如前所述,融化曲线分析可以用来检查qPCR产品的身份,对dye-based放大来说尤其有用。积极控制井(在一个设计良好的试验)应该给干净的峰值的熔化温度指示qPCR产品(图15)。如果峰除了这些观察井,它表明非目标产品的存在,意味着量化在这些井是不可靠的。同样,缺乏目标峰值表明缺乏目标扩增子的情况下,显示的是负的。

图15: qPCR融化曲线分析的例子。分解温度显示在x轴上。荧光的变化是显示在右边轴(虚线);在低温下的DNA双链形式,它有100%的荧光,减少随着温度的增加和DNA解离。左轴显示Rn,峰值对应的融化温度qPCR产品(s)。

qPCR vs PCR

qPCR和聚合酶链反应,放大过程发生在几乎相同的方式。然而,有显著的差异。

• 与传统PCR,有时也称为端点PCR,产品评估的放大过程中,通常通过琼脂糖凝胶电泳。与qPCR,测量每个放大周期结束时使用荧光记者。因此,实际的放大过程本身就是跟踪而不是最终产品。
• 包含标准已知目标的拷贝数允许拷贝数未知的样本确定与PCR qPCR这是不可能的。因此qPCR可能比PCR,量化是必需的。
• 检测的局限性qPCR通常低于实现通过琼脂糖凝胶电泳(qPCR比PCR)敏感所以可能期望使用qPCR目标复制数字可能较低。
• 将探针在某些qPCR比PCR方法可以更具体的技术。
• 在qPCR通常小于扩增子PCR (80- - - - - -比200年150个基点- - - - - -1000年英国石油公司或更多)。
• 不像PCR,下游实验中经常使用的产品如基因工程或测序,qPCR产品很少用于任何进一步的目的。

qPCR vs dPCR

数字PCR (dPCR)²³放大目标区域的DNA、cDNA qPCR几乎以相同的方式,使用引物和探针。然而,它不同于qPCR样品处理和反应的方式和目标是如何测量的。

反应混合分割成许多井之前放大,这样每个作为一个单独的反应,每个包含一个或没有副本的目标。该方法依赖于假设样本分区将遵循泊松分布。放大后,井得分为正(荧光)或负面(不是荧光)然后绝对定量计算各井起源于相同的初始样本(图16)。

井取得了积极或消极的,放大过程本身并不像qPCR跟踪,而是荧光测量的放大。也与qPCR dPCR不纳入标准量化是绝对的,节省时间和金钱和移除依赖校准曲线。应用dPCR包括门店库量化、病原体检测和基因转录的研究,技术已被证明有高灵敏度和准确性。罕见的事件检测²⁴临床研究是一个地区在特定dPCR已经蒙恩qPCR由于其优越的敏感性。

图16: 工作流dPCR实验和结果解释。

qPCR测试的目的是什么?

qPCR发现许多应用在生命科学的许多领域包括诊断、基因组学、环境和食品分析。让我们考虑一些常见的用途。

• 转录的研究——而qPCR使用DNA或互补DNA作为模板,将RT意味着qPCR是一个非常有用的定量工具在研究基因转录。²⁵这可以告诉研究人员开启或关闭的基因在健康或疾病,²⁶表明如果一个治疗或某些物质的管理影响有机体在转录水平,确定不同人群的差异或表明遗传操纵的连锁影响。使用多路复用,可以分析很多记录在一个反应。
  
• 诊断——qPCR的地方在传染病的诊断人类,动物和植物和遗传标记的检测,如突变。
  
  在传染病,¹⁸如严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)链球菌感染,²⁷具体,保守地区的病原体是有针对性的。哪里有相当大的人口变化,重要的是目标区域显示变异率低,存在于所有或大多数菌株,以避免假阴性。使用多个目标在同一生物体,可以多路复用,可以帮助减少假阴性。定量数据可以帮助评估致病性负载,可能通知治疗或管理决策,如果之后随着时间的推移,有时可以表明感染的病人是在什么阶段(增加或减少浓度)。qPCR甚至可以用于环境样品,等废水,帮助流行病学家监视和预测疾病的传播。
  
  先天性疾病,如亨廷顿氏舞蹈症,²⁸qPCR可以用来确定个体遗传标记(s)相关的疾病或疾病有关的危险因素。这个应用程序在个人和产前和胚胎植入前的测试。^29日这可能是一个突变这样的单核苷酸多态性(SNP),删除或插入,包括重复和微卫星重复的数量的变化。这种类型的基因型也可能目的除了基因疾病诊断包括选择育种的应用程序。
  
  遗传标记也可以检测到可以显示可能的病人是如何应对某些药物或疗法,通知治疗方案。
  
  在癌症诊断、qPCR可以用来寻找改变标记的肿瘤基因转录模式的变化。^30.
  
• 总会在图书馆量化——门店现在是一个常用的工具诊断,流行病学、基础研究、微生物研究和环境分析等等,不一而足。然而,对于成功的测序,从样品库准备必须量化,以确保最优加载到测序平台。^31日使用适配器序列设计引物,旁边挥动碎片允许科学家来确定他们的样品有独立的样本序列或选择片段大小和相应计算。
  
• 污染物检测/真实性的决心——qPCR可用于检测基因序列的污染物,是一种细菌,病毒,寄生虫,甚至其他动物物种。这是特别相关的食品安全设置和环境分析。真实性的决心和食品检测欺诈也采用相同的原则确定种或亚种内基因组样本在的情况下2013年马肉丑闻。
  

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