ddPCR技术在CAR - t细胞制造中的质量控制

嵌合抗原受体(CAR - T细胞)从肿瘤测序到基因工程和免疫治疗，在科学上取得了多项重大进展。不出所料，CAR - t细胞疗法是自免疫疗法首次进入临床以来最受期待的肿瘤治疗方法之一。这种方法利用了T细胞在体内寻找外来入侵者并将其摧毁的自然能力，并通过靶向基因工程增加了选择性。根据ClinicalTrials.gov的数据，FDA已经批准了三种CAR - T疗法，并着眼于更多，目前有超过650个CAR - T细胞试验正在进行或正在招募。¹一项预测预测，到2028年，全球CAR - t细胞治疗市场可能达到80亿美元。²

CAR - t细胞疗法制造商的商业销售只有几年的时间，他们仍在解决问题。CAR - T细胞不是典型的药物，生产它们面临着独特的挑战。它们是活细胞，这意味着制造商在某种程度上依赖细胞的生理运作来整合和表达车适量的基因。由于这一过程并不完全在制造商的控制之下，生产安全有效的CAR - T细胞的过程需要严格的质量控制。

降低对患者的伤害风险

CAR - T细胞的制造过程始于从患者血液中提取T细胞。然后科学家使用病毒载体，转座子系统，或直接mRNA转导插入车基因进入细胞的DNA。这使得它们能够在表面表达CAR蛋白。最后，科学家在生物反应器中扩增工程细胞，医生给病人注射他们自己的改良T细胞。制造商需要监控这一过程，以确保细胞正常运作，不会对患者造成伤害．

在转染或转导过程中出现了一个挑战:一旦车基因被传递到细胞中，制造商无法控制它将在哪里整合到细胞基因组中。它可以嵌入调控致癌基因表达的DNA片段中，从而促进肿瘤生长。或者，它可以整合到基因组的沉默区域，永远不会被表达．

除了控制站点的集成外，控制站点的复制数量也是一项挑战车基因整合到T细胞的基因组中。这会影响细胞的安全性和功能。如果基因不能整合，细胞就不能完成其预期的功能。相反，如果基因整合的副本太多，细胞就会变得有毒。它产生的蛋白质可以诱导全身炎症反应，称为细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”，可以损害器官并导致死亡。为了规范这一点，美国食品和药物管理局(FDA)建议，当制造商使用逆转录病毒/慢病毒载体时，应注意车每个细胞的基因拷贝数不超过4个。^3.因此，制造商必须进行监控车还有基因拷贝数。

利用ddPCR检测CAR - t细胞质量

今天，科学家们主要依靠定量聚合酶链式反应(qPCR)来量化车基因拷贝数，但这项技术只能提供相对的结果。qPCR不能直接量化基因拷贝;相反，科学家们需要将他们的结果与标准曲线进行比较。反过来，这需要使用串行稀释来生成，这是一个耗时且不可靠的过程。qPCR固有的可变性使得几乎不可能检测到每个细胞中只存在一个副本的基因．

相比之下，液滴数字PCR (ddPCR)可以检测每个细胞一个基因拷贝。虽然ddPCR和qPCR都使用相同的化学成分，但ddPCR直接定量基因序列，其灵敏度要高得多。在实践中，ddPCR将一个样本分成数万个纳升大小的液滴，并对每个液滴中所含的核酸链进行独立的PCR反应。的车Gene会放大并发出荧光信号，照亮它所在的液滴，而其余液滴保持黑暗。这为科学家提供了每个液滴的二进制结果，以精确量化那些包含目标序列的液滴。由此，人们可以计算样本中基因的浓度，并得出该批T细胞中的平均基因拷贝数．

通过直接定量核酸序列，ddPCR不需要标准曲线。而且，因为它足够灵敏，可以探测到车每个细胞的基因拷贝，制造商可以确定他们的转染或转导方法是否成功．

采用ddPCR和流式细胞仪进行研究车转导

在美国国立卫生研究院(NIH)临床中心，金平博士证明了ddPCR可以可靠地量化车使用慢病毒或逆转录病毒载体转导后T细胞中的基因序列。Jin和她的团队将一批T细胞转导到车基因，然后分离和纯化几个CAR - T细胞的基因组，并评估转导方案的成功．⁴他们用流式细胞仪测量了转导效率，并量化了细胞的活性车ddPCR法检测每个基因组的基因拷贝数。

本研究中，ddPCR在定量上是一致的车拷贝数。他们发现，无论样本是立即检测还是冷冻三、六周后检测，结果都是一样的。三名不同技术人员的结果也一致，证明了该技术的高可靠性和鲁棒性。

研究人员检查了两个变量的影响，感染的多样性(病毒载体与T细胞的比例)而离心对转导效率和拷贝数的影响。他们分别使用流式细胞仪和ddPCR检测发现，转导效率和拷贝数随着感染多重性(MOI)(病毒:细胞比)的增加而增加，并且转导效率和拷贝数直接相关。最后，使用ddPCR，他们发现在MOIs较低范围内看到的低拷贝数随着高速离心而增加。

最后，他们绘制了地图车利用下一代测序(NGS)沿着基因组整合转基因。在未来，Jin的团队也希望在这一步中使用ddPCR。虽然转染或转导的基因随机整合，但它们显示出对基因组中特定位点的偏好。一旦确定了这些位点，Jin和她的团队计划设计专用的PCR探针，使他们能够检测这些位点的整合。总的来说，ddPCR比NGS提供了更短的周转时间。

综上所述，Jin的数据表明，ddPCR可靠地量化了临床CAR - T产品中的转基因拷贝数，并可以补充流式细胞术，支持CAR - T制造方案的改进。研究人员通过流式细胞术检测MOI与转导效率的关系，通过ddPCR研究MOI与拷贝数之间的关系，进而研究拷贝数与转导效率之间的关系。有了包括ddPCR在内的一套工具，CAR - t细胞制造商可以更有信心，他们的产品是安全的，它们将有效地治疗癌症．

Jin的工作只强调了ddPCR可以帮助CAR - t细胞制造的一个领域，但考虑到它的多功能性，有一天它可能会帮助过程的所有方面，包括上游和下游。

引用:

1. 搜索:“car+t”:活跃，不招聘研究-列表结果。ClinicalTrials.gov。https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=%22car%2Bt%22&Search=Apply&recrs=d&age_v=&gndr=&type=&rslt=．访问于2021年3月19日。

2. 连贯的市场洞察。到2028年，全球CAR-T细胞治疗市场将价值80亿美元。环球新闻编辑室。https://www.globenewswire.com/news-release/2018/05/31/1514897/0/en/Global-CAR-T-Cell-Therapy-Market-to-be-Worth-US-8-Billion-by-2028-Coherent-Market-Insights.html．2018年5月31日出版。访问于2021年3月19日。

3. 赵杨，史捷涛，施耐德。制定了第一个世界卫生组织慢病毒载体标准:面向慢病毒基因治疗产品的生产控制和标准化。Hum基因Ther方法．2017; 28(4): 205 - 214。doi: 10.1089 / hgtb.2017.078

4. 陆安，刘华，史锐，等。液滴数字PCR技术在临床CAR/TCR T细胞产物中检测载体拷贝数的应用翻译医学杂志．2020; 18(1)。doi: 10.1186 / s12967 - 020 - 02358 - 0

作者简介:

Mark White是数字生物集团Bio-Rad实验室生物制药产品营销总监。