意识到潜在的自上而下的蛋白质组学
增长超越了早期的“概念验证”的研究,自上而下的蛋白质组学现在在许多实际应用中广泛用于分析完整的蛋白质。在这里,我们将讨论如何自顶向下的蛋白质组学方法出现,支撑其成功的原因,强调一些最激动人心的当前进展。
“自下而上”方法的进化
从历史上看,当有人想破译蛋白质的序列,他或她会好老湿化学,比如埃德曼降解技术。量化的特定蛋白质在生物样品,他们会依靠基于抗体的方法;例如,一个定量免疫印迹或ELISA测定。然后分析蛋白亚型,完整的蛋白质或蛋白质复合物,要么二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,本机凝胶电泳或凝胶排阻层析法。这些方法都活得好好的,部分原因是一个单一的技术是不可能完全解决和描述特定的蛋白质。然而,快进几十年,技术进步在色谱,质谱(MS)和生物信息学MS-based蛋白质组学作为一个明确的最喜欢的执行这些分析任务。
蛋白质组学领域的主要进化“自下而上”的技术。
在自底向上的实验完整的蛋白质从细胞或组织中提取溶菌产物和proteolytically消化成肽。与sequence-specific酶消化通常是实现,例如胰蛋白酶或endoproteinase Lys-C。接下来,混合使用液相色谱分离,引入质谱仪MS / MS分析。一旦进入仪器,肽与中性分子气体和轰炸分解成更小的碎片,这一过程称为collision-induced离解(尽管其他碎片技术也在使用)。然后推断出原文的序列蛋白质样品中,肽MS / MS谱相比,理论来源于分裂模式在网上消化蛋白质数据库。
“我们之所以使用自底向上的方法,有时也称为“猎枪”蛋白质组学,是我们经常可以执行非常健壮且可再生的识别和量化分析,“Ole n . Jensen说蛋白质质谱教授生物化学与分子生物学;欧登塞的南丹麦大学。
如果做正确的方法是快速和提供高蛋白质组覆盖良好的检测极限。“我们使用自底向上的另一个原因是,胰蛋白酶生成漂亮的适合质谱肽,我们得到非常高的灵敏度在我们的实验中,”詹森教授补充道。
自上而下的蛋白质组学的定义
然而,尽管自底向上的很多好处,我们仍然需要其他的方法。“我们知道蛋白质是几乎从不修改只有一个翻译修饰(天车),“Simone Sidoli,詹森的前成员的团队,现在佩雷尔曼医学院的博士后研究员,美国宾夕法尼亚大学。”和识别天车共存时,例如为了明确地确定某些天车存在的组蛋白变体,猎枪女士方法斗争”。
“自上而下”这个术语是用来描述一种蛋白质组学方法,蛋白质是不保持酶消化成肽。他们引入的质谱仪完整的状态而不是。然后将这些完整的蛋白质直接分析,之前经历的碎片。过程减少最初的样本复杂性,至关重要的是保留了多功能天车之间的连接,序列变化,可变剪接,或任何其他特性最初出现在每一个完整的蛋白质分子被分析。支持自顶向下的成功Fourier-transform-based蛋白质组学的发展,和四极time-of-flight-based高分辨率女士同样,高效的破碎方法的引入,如电子转换离解和高能碰撞离解一直是关键所在。
科学家现在可以访问信息,将无法在一个标准的猎枪实验中,允许他们我)询问大蛋白质的结构,2)映射组合的多功能天车使用全序列覆盖率,和3)识别和衡量proteoform分布。
使用自顶向下做马克:阅读组蛋白修饰
和许多新技术一样,早应用程序自上而下的蛋白质组学的主要关心如何证明该平台可以作为目的和适用于工作回答重要的生物学问题。不足为奇的是,作为一个理想的工具映射共存天车,染色质生物学的技术在这一领域取得成功以及组蛋白天车的表征。
组蛋白是小,带正电荷的蛋白质,帮助包细胞核内染色体DNA。“我个人的观点是,我们不应该认为组蛋白蛋白质“做”的事情;他们不是酶。然而,这并不意味着他们不太重要,“Sidoli博士说。“基于组蛋白是如何组装和修改,他们定义染色质结构,和细胞染色质的控制面板。“重要的是,大量的化学修饰组蛋白氨基酸(N)终端尾巴调节染色质结构和稳定,影响基因表达的许多方面。研究最多的一些修改包括乙酰化、甲基化、磷酸化。越来越多的证据表明,各种蛋白酶能够剪辑的组蛋白尾巴,导致一个额外的监管层。
詹森教授和他的团队在丹麦一直在研究这些修改在过去的10年。在一项研究中,发表在《华尔街日报》分子和细胞蛋白质组学,他们使用自顶向下的方法来显示完整和人类组蛋白装饰着剪不同的多功能天车模式。他们首先培养一个人肝癌细胞系在两个不同的文化;标准二维(2 d)细胞单层膜,和三维(3 d)球体文化旨在更好地模仿在活的有机体内细胞环境。他们发现组蛋白在三维培养剪,而那些生长在2 d保持完好无损。使用自顶向下的策略,他们当时能够识别剪切发生的地点。进一步分析显示女士的相对丰度差异系列多功能天车完好无损,剪组蛋白proteoforms。
“这是一个新发现。人先前表明组蛋白是夹在不同的网站。但在这里,我们表明,铝,主要是甲基化状态,在这种情况下也有所不同,”詹森教授说,“这是令人兴奋的,因为它指向一个监管机制。”
单克隆抗体的结构性特征
自顶向下的分析也成为生物制剂的特性的一个重要工具,即药品生产的活细胞。“自顶向下方法的美妙之处在于,原则上可以获得所有的修改在你最感兴趣的一个完整的蛋白质。效果特别好如果你有大量的纯化蛋白。这是什么制药业的时候他们与蛋白质生物制药工作,”詹森教授说。
事实上,越来越多的抗体,产生生长因子,白细胞介素,带到市场。这些分子是更复杂的比传统的有机化合物。他们描述的深度和质量肯定因此就高。此外,proteoforms生产制造过程的变化可以影响这些药物的疗效和安全性。完整的描述需要履行监管标准。
以重组单克隆抗体(mab)为例。这些大型,y形的糖蛋白结合目标抗原特异性高的重要疗法针对癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病。子单元的特征通过自上而下的蛋白质组学已经成为一个重要的序列分析技术验证或确定多糖的修改。
对未来的一种工具
尽管近年来很大的进步,一些自上而下的蛋白质组学的挑战依然存在。技术是相对的低吞吐量比自底向上实验,部分是因为困难自动化液相色谱分离完整的蛋白质。然而,在发展有用的替代。最近的一次研究鉴定报告近六千proteoforms使用毛细管区带电泳从大肠杆菌蛋白质组加上一个商用Fourier-transform-based质谱仪。
总体而言,该领域将扩大其范围和在未来成为一个不可缺少的研究工具。“自上而下快速开发,但它不会在一夜之间发生,”詹森教授说,“我认为在未来5到10年,我们会看到巨大的进步。”
