RNA-Seq:基础知识、应用程序和协议

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发表:2018年4月6日

|最后更新:2022年9月15日

Ruairi J麦肯齐

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RNA-seq是什么?

RNA-seq (RNA-sequencing)是一种技术,可以检查的数量和序列RNA样本使用下一代测序(门店)。分析了转录组,表明在我们的DNA编码的基因开启或关闭,到什么程度。在这里,我们看看为什么RNA-seq是有用的,技术是如何工作的,今天常用的基本协议。¹

RNA-seq的应用是什么?
RNA-seq是如何工作的呢?
RNA-seq vs微阵列:为什么RNA-seq被认为是优越的
一个RNA-seq协议
- - - - - -实验计划
- - - - - -互补脱氧核糖核酸库的准备
- - - - - -互补脱氧核糖核酸测序
- - - - - -RNA-seq数据分析
RNA-seq的挑战

RNA-seq的应用是什么?

RNA-seq让我们调查和发现的转录组,总细胞rna的内容包括mRNA,核糖体rna和tRNA。了解转录组是关键,如果我们要连接的信息在我们的基因组功能的蛋白质表达。RNA-seq可以告诉我们哪些基因在细胞打开,他们的水平转录,什么时候他们被激活或关闭。²这让科学家更深入地了解细胞的生物学和评估变化可能表明疾病。一些最流行的技术,使用RNA-seq转录分析,单核苷酸多态性(SNP)识别、³RNA编辑和差异基因表达分析。⁴

这可以给研究人员重要的功能基因的信息。例如,转录组可以强调所有的组织未知功能的基因,这可能表明它的角色是什么。它还捕获可变剪接事件信息(图1),而产生不同的成绩单从一个单一的基因序列。这些事件不会被DNA测序。它还可以识别转录后的修改发生在mRNA加工聚腺苷酸化和5 '等限制。²

图1:RNA-seq数据使用短读的mRNA免费intronic非编码DNA。这些读必须对齐参考基因组。

RNA-seq是如何工作的呢?

早期RNA-seq技术利用Sanger测序技术,技术,虽然当时创新也是低吞吐量和昂贵的。直到最近,随着和扩散门店技术,我们能够充分利用RNA-seq的潜力。⁵

一个RNA-seq工作流有几个步骤,可以大致概括为:

RNA提取
反转录成互补脱氧核糖核酸
采用结扎
放大
测序

一旦你获得RNA样本进行分析,第一步的技术包括RNA基因组的人口转化为互补的DNA片段(cDNA文库)(互补)。这是通过逆转录和RNA可以放入一个门店的工作流程。互补脱氧核糖核酸就支离破碎,适配器添加到每个片段。这些适配器包含功能性元素允许排序,例如,放大元素(促进克隆片段的扩增)和主测序启动站点。放大的过程后,尺寸选择、清理和质量检查,然后分析了互补脱氧核糖核酸库门店,产生对应的短序列片段的全部或部分从它派生的。图书馆的深度测序根据不同目的的输出数据将被用于。测序可以遵循单头或paired-end测序方法。Single-read测序是一种更便宜、更快的技术(供参考,大约1%的桑格测序成本)序列的cDNA片段从一端。Paired-end方法序列的两端,因此更昂贵^6,7但在post-sequencing数据重建提供优势。

进一步的选择必须strand-specific和non-strand-specific之间的协议。前方法意味着DNA链被转录信息保留。额外的信息的价值从strand-specific协议让他们获得有利的选择。

这些阅读,其中将会有数百万的工作流,可以对齐到一个参考基因组是否可用或组装新创产生一个RNA序列跨越了转录组的地图。⁸

RNA-seq vs微阵列:为什么RNA-seq被认为是优越的

RNA-seq被广泛认为是优于其他技术,如微阵列杂交。有几个原因RNA-seq德高望重的状态:

不限于基因组序列不像hybridization-based方法,可能需要种特异的探针,RNA-seq可以从生物检测记录与之前不确定的基因组序列。这使它从根本上优越的小说的检测记录,单核苷酸多态性或其他改变。^9,10

低本底信号,的cDNA序列用于RNA-seq可以映射到目标区域的基因组,这使得它容易去除实验噪音。此外,交叉融合的问题或劣质杂交,可瘟疫微阵列实验,不是RNA-seq实验中的一个问题。

更多的可量化的,微阵列数据只显示值相对于其他信号检测到数组,同时RNA-seq数据是可以量化的。RNA-seq还避免了问题微阵列探测很高或很低的转录水平。

图2:一个工作流RNA-seq

一个RNA-seq协议

实验计划

准备开始之前RNA-seq实验是必不可少的。回答之前的问题包括:¹¹

•核糖核酸纯化方法你用的什么?

•阅读深度需要什么?

•您使用哪个平台?

•有参考基因组可用,你会使用吗?

•你评估你的RNA质量如何?

•你需要RNA来丰富你的目标吗?

•你条形码RNA吗?

•我有足够的生物和技术复制吗?

•单头或paired-end测序吗?

•阅读长度你会使用什么?

•我想保留strand-specific信息吗?

互补脱氧核糖核酸库的准备

这些点被认为是后,可以开始准备你的互补脱氧核糖核酸库。这将需要分裂的cDNA、特定于平台的“适配器序列”和放大的cDNA,但确切的过程将会非常具体的在这个阶段使用的平台。strand-specific协议,放大的cDNA涉及反向transcriptase-mediated第一链合成DNA polymerase-mediated第二链合成紧随其后。^11,12条形码也可以被添加,使多路复用,因此大量的样本可以测序在单个运行。它可以有利于量化你的图书馆在图书馆准备阶段,确保协议已经成功和检查你的图书馆的质量和浓度,使最优排序性能。

互补脱氧核糖核酸测序

一旦准备好图书馆,您可以使用您选择的测序平台,你的cDNA序列库所需的深度和要求。一旦你的记录数据已经产生,你可以将数据映射到参考基因组或组装起来新创如果没有可用的参考。对齐过程可以通过拼接变异和复杂的修改,和参考基因组的选择也将改变这个阶段是多么困难。软件包等明星是有用的在这个阶段,皮卡德等质量控制工具或Qualimap。¹³ 新创大会将允许对小说文本的发现除了那些已知。

RNA-seq数据分析

对齐后阶段,你可以关注分析你的数据。旗鱼等工具,RSEM BitSeq¹³将帮助你量化转录水平,虽然味噌等工具,量化或者拼接基因,可为更专门的分析。¹⁴这些工具有一个图书馆,和阅读评论和综述是你最好的方法为你的研究找到合适的工具。

总之,现代RNA-seq远为优越的选择微阵列和可能仍然是首选的选择。

RNA-seq的挑战

已取得显著进展领域的RNA-seq过去十年左右的时间。相关的成本大幅降低吞吐量增加时,富达远远优于早期的迭代序列捷技术和数据分析工具和管道的可用性大大改善了。然而,仍然有许多挑战科学家要记住当考虑RNA-seq实验。这些包括:

隔离充足,高质量核糖核酸——虽然RNA-seq分析的样本数量要求大幅减少,它仍然是重要的,以确保你能获得足够的RNA来满足你所有的需求分析,包括在必要时重复。同样重要的是要记住,当你孤立总RNA,根据你的实验问题,你可能只会成为测序一小部分(通常的信使核糖核酸(mRNA)),进一步减少样本数量。这也必须是高质量和纯度的不好的样品可能会导致不良的结果,或在某些情况下故障在图书馆准备协议。的质量和浓度RNA可以决定使用紫外可见光谱。与DNA, RNA降解迅速所以小心对待很重要样品阶段的隔离和净化。退化可能不统一,阻碍转录水平基因之间的比较。低级的成绩单从完全测序的人口可能会丢失。

样品池的影响——池样本库前准备(没有使用条码)可以降低测序的努力和成本或使测序在这种情况下,样本数量是非常有限的。然而,重要的是要考虑在数据分析,与这样一个池是一个生物复制,不但是很多样品在池中。混合样本之间的差异可能会导致和误导的结果统计问题所以可能在实验设计过程中应该考虑的影响。

权衡测序深度对样本数量——它似乎吸引完成尽可能多的样品在一个测序机器运行尽可能减少成本和时间。然而,这是有代价的。样品是多路复用越多,越少读将获得这些样本。减少阅读深度带来了越来越多的不确定性序列获得的可靠性。测序技术还远不完美,在读取和错误。因此重要的是要获得足够的阅读之间找到平衡点深度给质量的信心和忠诚的测序数据获得和确保最大化测序能力足够的生物复制可以给有意义的数据分析。

引用

1。斯奈德王Z,格斯坦M & M . RNA-seq:转录组的一个革命性的工具。Nat。启麝猫,2009;10 (1),57 - 63。doi:10.1038 / nrg2484

2。Ozsolak F &米洛斯岛点。RNA序列:进步,挑战和机遇。Nat。启麝猫,2011;12 (2),87 - 98。doi:10.1038 / nrg2934

3所示。Bakhtiarizadeh先生,Alamouti AA。基于RNA-Seq基因变异的发现提供了新的见解控制脂肪沉积在绵羊的尾巴。Sci代表13525 (2020)。doi:10.1038 / s41598 - 020 - 70527 - 8

4所示。张高汉Y,年代,Muegge K, W,周& b .先进的应用RNA序列和挑战。Bioinform。医学杂志。的见解,2015;9 (1),29-46。doi:10.4137 / BBI.S28991

5。舒斯特尔SC,下一代测序将今天的生物学。Nat方法。,2008;5(1),16日至18日举行。doi:10.1038 / nmeth1156

6。摩根大通Sulzberger哥伦比亚基因组中心。基因组测序:定义你的实验。哥伦比亚系统生物学。https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment。2021年8月24日通过。

7所示。功能基因组学。EMBL-EBI。https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/functional-genomics-ii-common-technologies-and-data-analysis-methods/rna-sequencing/performing-a-rna-seq-experiment/design-considerations/。2021年9月6日通过。

8。张赵年代,Y,戈登•W et al。比较困和non-stranded RNA-seq基因重叠的转录组分析和调查。BMC基因组学,2015;16 (1)。doi:10.1186 / s12864 - 015 - 1876 - 7

9。赵年代,Fung-Leung W-P, Bittner非政府组织K,与刘x比较RNA-seq和微阵列的激活T细胞的转录组分析。《公共科学图书馆•综合》,2014;9 (1),e78644。doi:10.1371 / journal.pone.0078644

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11。Kukurba KR,蒙哥马利某人核糖核酸测序和分析。冷泉Harb Protoc。2015,2015 (11):951 - 969。doi:10.1101 / pdb.top084970

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13。Conesa,情歌P, Tarazona年代,et al。RNA-seq的最佳实践的调查数据分析。基因组医学杂志,2016;17。doi:10.1186 / s13059 - 016 - 0881 - 8

14。Katz Y,王等,Airoldi EM Burge & CB。分析和设计的RNA序列实验识别同种型监管。Nat方法。,2010;7 (12),1009 - 1015。doi:10.1038 / nmeth.1528