解决挑战的自动化1 d和2 d定量核磁共振(qNMR)光谱使用工艺
引入“二维(2 d)核磁共振(NMR)谱在1970年代中期被公认是一个决定性推进现代核磁共振分析。这是理查德·恩斯特的工作和他的同事们在苏黎世瑞士,同一组,大约10年前,发达的傅里叶变换(FT)核磁共振。里程碑都是在1991年获得诺贝尔化学奖。
快进到近代,当渴望自动定量核磁共振(qNMR)分析已经成为解决的挑战。方法增加吞吐量的数据收集和/或减少光谱信息收集表格格式一直是关注的焦点。然而,尤其是高度复杂的样品,瓶颈可以坚持至关重要,从用户手动干预,指导成为必要。
时域分析(即提取频率,振幅,线宽,和相位直接从FID)提出了减少过去的数据表。现在,快速发展的工艺(完成减少振幅频率表)[1]的方法不仅是建立数据处理替代传统的步骤对于“一维(1 d)应用程序,而且相关的二维分析。
在本文中,我们目前最近的数据从一系列的1 d和2 d qNMR工艺的应用,包括经典quant-purity分析混合物分析和复杂的一道研究。
为什么2 d NMR ?
早期的实验导致2 d NMR的发展已经写过广泛——2015年在共振的一篇文章[2]和伴随的文档奖1991年诺贝尔化学奖[3]——也许感兴趣的读者的理想背景。
总之,2 d NMR使用核旋转磁场中受到的射频脉冲序列而不是单脉冲。实验的时间进程分为四个间隔。在“准备阶段”,核自旋系统的平衡是由一个或多个脉冲失真。这允许非平衡发展在一定时间(“进化期”),之后,接下来的一系列的脉冲(“混合期”)导致了“检测”。这里的核磁共振信号检测作为时间的函数一样普通,1 d英尺NMR。
进一步的准备时间是煽动,实验重复不同演化时期。进化时期的变化导致信号测量检测期间改变。这给了一个二维表与信号强度的函数在检测期间的时间点和演化周期的长度。最后,傅里叶变换进行两次——对这两个时间参数,获得二维频谱的地图的形式的依赖在两个频率信号强度参数。
的光谱信息生成更高的分辨率,使重叠峰的歧视。根据设计的准备和混合时间,各种各样的2 d NMR实验可以完成。一些传播信息两个维度,而不是一个(交互)的分离,而别人是为了寻找核有某种形式的联系(信号)的相关性,为例。
关键的好处qNMR
核磁共振可以用于几乎所有的有机化合物,可以制成一个解决方案。重要的是,物质难以定量分析使用标准色谱没有物质,如新的化合物,或未知材料,可以使用qNMR定量分析。可以使用一个参考物质的定量分析测量目标。
没有必要为qNMR创建校正曲线和不需要调节执行测量。如果一个适当的协议,qNMR可以用来执行SI可追踪的纯度评估,因此可以保证结果的可靠性。
常规的质子核磁共振测量条件不适合定量分析。
图1显示了一个比较典型的常规条件和参数的定量条件。常规条件下的默认设置是仪器用于测量质子。定量条件是基于日本药典中指定的条件。参数差异可以很广泛,但有六个具体参数,应考虑与脉冲重复时间和扫描的两个最重要的数量。
| 典型的参数 |
例程 |
定量 |
| 脉冲重复的时间 |
~ 7秒 |
> T1x 7 |
| 脉冲翻转角度 |
45° |
90° |
| 扫描 |
8 |
S / N > 100 |
| 数字分辨率 |
0.5赫兹 |
< 0.25赫兹 |
| 样品旋转 |
在 |
从 |
| 13C解耦 |
从 |
在 |
图1:典型参数常规和定量测定条件。
工艺
首次提出一个健壮的和容易的方法定量混合分析,2013年工艺使用贝叶斯统计方法将核磁共振直接时域数据转换成表格域(图2)。与工艺,频域数据(“频谱”)不超过表格域的可视化工具,与“传统工艺”,表格域来源于谱由一位有经验的光谱学家。重建后,模型数据取自振幅频率表的每个组件的一个例子1核磁共振测量番木鳖碱是如图3所示。注意,重建跟踪(绿色)几乎是相同的原始,测量,跟踪(蓝色)-小差异显示剩余跟踪(布朗)。
图2:直接在表格形式输出工艺:数据。
图3:工艺的分析1番木鳖碱的氢。
工艺在实践中
研究1。有针对性的使用1 d NMR分析复杂混合物
工艺是用来量化一个复合在一个非常复杂的混合物。在这一系列的实验中,核磁共振定量蛋黄的胆固醇是使用工艺执行。准备一个合适的使用的材料和方法示例如图4所示。
图4:材料与方法:准备蛋黄样品核磁共振。
图5: 1H定量核磁共振光谱的蛋黄脂质与内部标准。
的1H定量核磁共振光谱的蛋黄脂质与内部标准收集(图5)。大多数信号来自甘油三酯。胆固醇的C18和C19甲基质子信号是高亮显示,这些被用于进一步的定量分析。
图6: 1H定量核磁共振光谱的蛋黄脂质与内部标准。
图6显示了如何量化每个信号的振幅是集。定义为每个信号指纹之后,感兴趣的区域(ROI)被定义在图6)(框1。由此产生的工艺结果显示在面板-振幅的标准越低,使用C18和C19胆固醇62.6,分别为22.8和21.2。
结论:这些数据被期待计算样品中胆固醇的绝对数量,发现0.929毫克/ 100毫克的蛋黄(图7)。
图7:计算在蛋黄胆固醇量(如自由形式)。
研究2。一道分析,核磁共振代谢组学研究
没有标准,没有指纹,工艺也擅长一道分析。这里,我们探索任何差异代谢物在西兰花种子生长有或没有光。
种子播种在1 wt %琼脂凝胶。一半是生长与光和另一半都没有成长为10天(图8)。极性代谢物提取西兰花的幼苗Bligh-Dyer方法和一系列的1H光谱被捕。Y芳香地区范围(8.5 - -5.0 ppm)比例——脂肪族地区的八倍(4.7 - -0.5 ppm)。在每个样本组八个实验进行复制。核磁共振光谱连续记录光谱仪配备一个探测和自动换样器。
图8 b显示了如何创建数据矩阵为非目标方法- 16光谱与和8(8)被打开了。指纹并不是这里定义,我们只是开始分析和等工艺完成。
正交投影判别分析潜在的结构(OPLS-DA),多元判别分析,进行探索代谢物特别是样本组(图8)。频率和振幅表作为输入使用的工艺分析矩阵,每个样本被总额规范化,每个频率被自动扩展了。OPLS-DA中的得分图显示了良好的歧视,R2和Q2值表明该模型是有效的。散点图的变量影响投影(VIP) vs假定值的平均两组样本之间的差异。
如果我们考虑到代谢物的VIP价值超过1,和p值小于0.05的特点,我们可以看到12个特征频率之间的两个样本组成功地识别。图8 d显示了这些代谢物的箱线图,给予良好的可视化的分布数量之间的两个样本组。在这里,代谢物与能量代谢有关植物生长与光的相对高于那些没有光。同时,几个氨基酸相对更高的没有光比栽培的植物。
结论:不同样本之间的特征代谢物组成功地识别和相对量化与工艺。
图8模拟:实验设置(a) /生成数据矩阵(b) / OPLS-DA探索标志代谢物(c) / 12箱线图特征代谢物(d)。
研究3。2 d qNMR蛔蒿素/腺苷酸混合物
传统的核磁共振谱(1 d光谱)块强度和频率;在二维光谱强度绘制两个频率的函数,通常被称为F1和F2。虽然二维工艺提供的主要优点是极大地增强了F1分辨率[4]最近的研究表示,也有可能我的2 d NMR数据振幅。通过获得大笔的交叉峰的振幅化合物,然后从混合物与数据供参考,与相同的脉冲项目,获得二维量化是获得一个简单的路线。图9显示了三分振幅与2 d异核单量子相干(HSQC)蛔蒿素和腺苷。使用这些已知的浓度和振幅,参考蜡烛是建立。这两个参考化合物的混合物的分析,报告的振幅与2 d工艺图10中可以看到。
结论:简单定量计算收益率量化与已知浓度的协议。
图9:蛔蒿素和腺苷的参考标准。4秒代表率xy16bebop HSQC。
图10:分析基于比率的蛔蒿素和腺苷的混合物从参考标准。
总结
工艺快速发展的方便让目标和一道定量分析1 d和2 d实验。正如我们以上所见,振幅的比较传统的2 d peak-pick和获得的二维交叉峰的2 d工艺几乎相同的比例,发现了2 d工艺的优点是不需要用户干预。此外,指纹识别工具现在可以显著提高电子表格结果输出的自动组织,这意味着自动化分析的目标接近,取代人类的洞察力和精力non-operator-biased计算能力。未来数月乃至数年将继续看到工艺的显著增加应用程序。
引用
[1]工艺-完成减少振幅频率表健壮和时间贝叶斯方法定量分析混合物通过核磁共振,粉剂Krish•克里希纳穆尔蒂。的原因。化学、51、821 - 829页(2013)。
[2]发展二维核磁共振:生物分子的结构确定解决方案。阿尼尔•库马尔。共振(2015)https://www.ias.ac.in/article/fulltext/reso/020/11/0995 - 1002。
[3]MLA风格:1991年诺贝尔化学奖。NobelPrize.org (2019) https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1991/summary/。
[4]中的工艺应用二维核磁共振数据处理。安德里亚·m·Sefler Krish•克里希纳穆尔蒂和大卫·j·罗素)。的原因。化学。特殊的文章DOI 10.1002 / mrc。4449年,2016年5月10日。
