寡核苷酸分析技术

寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，正越来越多地用于诊断和治疗。例如,DNA可引入免疫细胞，基因工程，以表达嵌合抗原受体蛋白，用于细胞免疫治疗。¹它们也被用作DNA折纸模拟病毒颗粒设计分子疫苗²各种RNA，包括信使RNA (mRNA)和小干扰RNA (siRNA)，也分别用于蛋白质的瞬时表达和用于治疗应用的干扰蛋白质表达。

需要高纯度的寡核苷酸

根据 Balasubrahmanyam Addepalli他是辛辛那提大学的研究副教授，尽管寡核苷酸的使用越来越多，但由于“失效序列和具有完整保护基团的最终产物”，纯化它们仍然具有挑战性。

使用固态合成等技术合成寡核苷酸可以在合成周期的每一步引入微量杂质。随着寡核苷酸长度的增加，纯产物的产率降低。对寡核苷酸的修饰——如聚乙二醇的附着以增强稳定性和生物利用度——也会在合成过程中引入杂质。

比较常见的杂质有:

• 反应失败导致N-1个短路
  
  
• N +1长链是由连续加入两分子磷酸酰胺和单步耦合形成的
  
  
• 不完全硫化和副反应的磷酸二酯残留量。

一个审查古德柴尔德雄辩地总结了自20世纪70年代以来已实现自动化的寡核苷酸合成技术。^3.随着寡核苷酸应用的增加，采用高效的方法对其进行纯化、分析和表征变得越来越重要。

寡核苷酸的纯化

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)是一种标准方法，可用于根据寡核苷酸的大小分离寡核苷酸。⁴聚丙烯酰胺凝胶首先由丙烯酰胺在交联剂的存在下聚合形成，形成网状的凝胶网络。然后施加电场，导致带负电荷的寡核苷酸向正极移动。根据寡核苷酸的大小，小分子比大分子更容易更快地通过凝胶网络。在一段时间后，不同大小的寡核苷酸会在聚丙烯酰胺凝胶中移动不同的距离，使它们能够根据大小提取和纯化。

然而，如果寡核苷酸大小相似，PAGE提供较低的分离分辨率，一些修饰甚至是不可分割的。此外，PAGE分离是费力和耗时的。这些限制促使了从PAGE到液体的转变 色谱(LC)方法 用于寡核苷酸纯化。⁵

有多种LC纯化寡核苷酸的方法。例如，离子交换LC分离离子和带电分子，如寡核苷酸，基于它们对离子交换器的亲和力。然而，寡核苷酸的二次折叠、三次折叠、二聚体和聚集体等结构必须首先用有机溶剂、高pH缓冲液或高温(55-65^oC)。

最流行的纯化寡核苷酸的技术是 离子对反相高性能(IP RP HP) LC ．⁶在该技术中，长链烷基胺以低浓度加入，在LC的流动相中与带负电荷的寡核苷酸结合。寡核苷酸在LC色谱柱中的保留和洗脱受寡核苷酸电荷和离子配对试剂中烷基链长度等因素的影响，如triethylammonium醋酸。例如，保留时间通常与寡核苷酸的电荷和离子配对试剂中长烷基链的疏水性成比例增加。通常，研究人员必须这样做 优化参数 如柱长、流动相流速、分离温度和用于寡核苷酸分离纯化的离子配对试剂缓冲成分。⁷IP RP HPLC的一个关键优势是，它也可以直接与质谱仪耦合，用于寡核苷酸的详细质量表征。

寡核苷酸的质量表征

分析寡核苷酸纯度的一种方法是用质谱(MS)分析它们的质量。一种常见的方法是 基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI TOF)质谱 ．⁸该技术使用带有化学基质的激光来电离寡核苷酸样本，然后通过飞行管加速离子到达探测器，探测器测量粒子计数作为时间的函数。TOF与分子质量成正比。MALDI TOF MS提供高通量，理想地用于分析50个碱基以下的寡核苷酸，因为电离效率和分离分辨率降低。还有一种风险，即修饰过的具有光敏性的寡核苷酸可能被强激光源破坏。

为了克服MS的局限性，科学家们也在结合各种技术。木村和他的同事最近结合深度测序和质谱鉴定转移RNA (t)RNA。⁹”深度测序是一种高通量的方法，在一次运行中读取令人难以置信的数量的RNA序列。 然而，深度测序无法识别预测修饰的化学性质。相比之下,女士分析了寡核苷酸修饰的组成和位置。tRNA是修饰最严重的RNA分子，历史上，使用MS识别它们的修改配置文件。 因此，在我们的论文中，我们利用了这两种分析的好处:采用深度测序来预测修饰位点，并进行MS分析来详细描述预测的修饰位点，”Kimura说。

另一种流行的方法是 电喷雾电离(ESI)质谱 ．该技术利用高压从液体样品中产生气溶胶，将目标分子电离成由不同质谱表示的多个电荷态，这些电荷态可以反卷积成母峰，以识别寡核苷酸和潜在的杂质。ESI MS是一种分析大于50个碱基的寡核苷酸的极好工具，由于它使用较温和的电离条件，适合于光敏感的寡核苷酸。然而，它的吞吐量比MALDI TOF ms低。因此，根据表征的紧急程度和误差容忍度，可以使用这两种方法中的任何一种。

寡核苷酸的结构特征

解析寡核苷酸结构的最有效的方法是使用x射线晶体学，这已经间接地与 多次获得诺贝尔奖 ．¹⁰x射线的波长与分子中约1.5埃的原子间键，可以提供高度详细的结构寡核苷酸。通过对散射x射线的分析，可以确定样品中的电子密度分布，重建内部分子排列。然而，由于相位信息的丢失，重建并不总是容易的，这必须使用傅里叶映射等计算方法来解决。为了克服相信息丢失的问题，提出了用核苷和寡核苷酸类似物合成核苷和寡核苷酸类似物的方法 硒 已经开发出来了。¹¹这些方法利用了重原子， 硒 ，作为异常散射中心或参考，以实现相位确定。

在x射线晶体学中样品制备的另一个主要问题是晶体结构的制备，这需要非常仔细和耗时。为了提高结晶的概率， 外消旋体 已经增加了分子接触的数量。¹²各种DNA序列和折叠构象的外消旋晶体结构，包括双链和四链，甚至已被证明适合于结构说明。RNA晶体学尤其具有挑战性，因为缺乏表面化学多样性和较差的灵活性-不是理想的晶体包装。为了解决这个问题，谢尔曼和同事们创造了Fab (fragments的一个ntib这里) 伴侣辅助RNA晶体学 便于晶体包装和加速相测定。¹³

另一种常用的描述寡核苷酸结构的方法是 核磁共振(NMR) ．¹⁴与x射线晶体学相比，核磁共振的优势在于分子不需要结晶。当处于强恒定磁场中的原子核受到弱振荡磁场的扰动时，它通过在原子核上发射具有磁场频率特征的电磁信号来响应。当外场的振荡频率与原子核的固有频率相匹配时，这种情况发生在共振频率处。因此，核磁共振谱提供了来自样品中不同原子核的特定共振特性的结构信息。根据实验的确切目标(如分辨率)，使用不同的NMR设置。例如，二维核overhauser效应光谱(NOESY)核磁共振谱可以将样品结构解析到5埃的分辨率。

未来的前景

寡核苷酸是诊断和治疗的重要资源，但为了使它们在临床上有用而没有不良副作用，它们的合成和表征必须严格。PAGE或LC的使用和MS的使用是分离和纯化寡核苷酸的关键步骤。然而，寡核苷酸的结构在它们的用途中也发挥着重要作用，例如利用它们的构象来模拟病毒颗粒。因此，像x射线晶体学和核磁共振这样的技术对于阐明寡核苷酸的分子结构至关重要，这将有助于了解它们的结构-功能关系，并推动寡核苷酸分子设计的使用，以增强在生物医学环境中的更大应用。寡核苷酸的特征也主要集中在基因组DNA，但是 RNA的修改在生理上也有重要作用。随着研究的深入，更多的RNA修饰及其作用也将被阐明。

引用:

1. 朴俊华，Rivière I，高宁，等。CD19 CAR治疗急性淋巴细胞白血病的长期随访。N英语J医学．2018, 378(5): 449 - 459。doi:10.1056 / NEJMoa1709919．

2.王志强，王志强，王志强，等。纳米级抗原组织在b细胞活化中使用DNA折纸探测的作用。自然纳米技术．2020; 15(8): 716 - 723。doi:10.1038 / s41565 - 020 - 0719 - 0．

3.寡核苷酸和修饰寡核苷酸的缀合物:它们的合成和性质的综述．Bioconjugate化学．1990; 1(3): 165 - 187。doi:10.1021 / bc00003a001．

4.陈志强，陈志强，陈志强，陈志强。毛细管凝胶电泳分离纯化寡核苷酸的研究进展。美国国家科学研究院．1988; 85(24): 9660。doi:10.1073 / pnas.85.24.9660．

5.张强，吕华，王玲，等。寡核苷酸的纯化和结构测定的最新方法。Mol科学．2016; 17(12): 2134。2016年12月18日发布。doi:10.3390 / ijms17122134．

6.王志强，王志强，张志强，等。应用液相色谱法对寡核苷酸进行表征。药物和生物医学分析杂志．2020; 182:113105。doi:10.1016 / j.jpba.2020.113105．

7.李文杰，李志强，李志强，等。离子对反相高效液相色谱分析寡核苷酸:保留预测。色谱仪A．2002, 958(2): 167 - 182。doi:10.1016 / s0021 - 9673 (02) 00306 - 0．

8.pies U, Zürcher W, Schär M, Moser H.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱:天然和修饰寡核苷酸质量和序列分析的强大工具。核酸研究．1993; 21(14): 3191 - 3196。doi:10.1093 / nar / 21.14.3191

9.Kimura S, Dedon PC, Waldor MK.比较tRNA测序和RNA质谱测量tRNA修饰。自然化学生物学．2020; 16(9): 964 - 972。doi:10.1038 / s41589 - 020 - 0558 - 1．

10.何超生，林志强，陈曼敏，等。电喷雾电离质谱:原理及临床应用。临床生物化学Rev．2003; 24(1): 3 - 12。

11.张伟，肖stak JW，黄志。单硒原子促进核酸结晶和x射线晶体学。化学科学与工程前沿“，．2016; 10(2): 196 - 202。doi:10.1007 / s11705 - 016 - 1565 - 3

12.Mandal PK, Collie GW, Kauffmann B, Huc I.外消旋DNA晶体学。Angew Chem国际教育英语．2014; 53(52): 14424 - 14427。doi:10.1002 / anie.201409014．

13.谢尔曼E，阿彻J，叶继东。Fab伴侣辅助RNA晶体学(Fab CARC)。入选:enifar E, ed。核酸结晶学:方法和规程．施普林格纽约;2016:77 - 109。doi:10.1007 / 978 - 1 - 4939 - 2763 - 0 - _7

14.斯普林康奈尔AM, Evich M, Germann MW。寡核苷酸的核磁共振结构测定。核酸化学现行规程“，．2018年,72(1):7.28.1-7.28.39。doi:10.1002 / cpnc.48