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全图,右图-用于代谢组学分析的高分辨率质谱


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代谢组学是一种重要的研究工具众多的研究领域包括药物研发、疾病研究和作物工程,以及生物制造等许多工业应用。获得可靠的测量依赖于准确的代谢物识别和可靠的、适当控制的数据生成,因此有效的方法是关键。

高通量、大规模的设备特别容易受到变化的影响。因此,工作流程的设计必须考虑到高精度和可重复性,以确保检测到的变化可归因于生物学。记录的光谱与真实标准进行比较,以进行有效的化合物鉴定,多次质量检查消除了样品制备、操作人员和仪器带来的变化。

虽然对一组目标代谢物的集中分析是有信息的和可靠的,但有时需要更广泛的范围来解释表型或探索超出已知的范围。全面的代谢组覆盖——检测样品中的所有代谢物——提供了这个范围,但对仪器和设置提出了很高的要求。首先,区分数百个代谢物潜在的样本需要一个
质谱分析(女士)系统具有高分辨能力,可分离质量密切相关的化合物。其次,该仪器必须无偏倚地获取多种电离模式的数据,以充分捕获代谢组的结构多样性。第三,每次运行都必须包括校准和控制,以准确分析目标代谢物,并便于对未知分子进行回溯挖掘数据。

现代质谱仪满足了前两个要求,它提供了出色的测量分辨率和分析通用性,而第三个要求则由精心设计的实验设计来满足。

分辨率,范围和多功能性-代谢组学见解的三位一体


高分辨率,精确质量(HRAM)质谱提供了代谢组学分析所需的分辨率,范围和多功能性,具有自信的识别,准确的定量和从样品到样品和运行到运行的稳健性能。

根据不同的模型,这些质谱仪可以达到高达的分辨率
1000000年。这种数据粒度提高了化合物鉴定的信心,对于产生接近光谱信号的质量分配非常相似的代谢物尤其重要。在这里,高分辨率给出了窄峰,即使在不同的浓度下也可以缓解代谢物的区分(图1)。HRAM系统还具有动态范围,可以测量超过五个数量级的分析物浓度,且变化最小。 最后,HRAM系统容纳多种分离技术,全面表征代谢物的不同物理化学性质。与各种色谱选项(如气相色谱和液相色谱)的兼容性以及快速极性切换是其在扩大光谱覆盖方面的通用性的例子。

图1。高分辨率提高了鉴别低水平关键代谢产物的选择性。资料来源:赛默飞世尔科学公司


良好的内部控制的价值


代谢组学分析,HRAM
工作流程包括质量检查,以确定目标代谢物分析和非目标光谱解释(回溯挖掘)测量的效用。内部控制是这些检查不可或缺的一部分。


控件的选择是由运行的目标决定的。在代谢组学分析的情况下,内部控制应该是参考化合物的混合物,以支持目标代谢物的鉴定,并代表化学类型、分子量、浓度和离子电荷的光谱。这些对照品以同位素标记代谢物混合物的形式在市售,图2说明了常用溶液的覆盖范围。

图2。跨越代谢组:代谢组分析的内部控制。资料来源:赛默飞世尔科学公司

内置于运行序列中的内部控制有两个目的。首先,将混合物连续稀释以作为校准剂运行,以获得样品代谢物的绝对浓度。其次,将标记的代谢物混合物以恒定的浓度添加到样品中。然后在整个运行序列中测量每个内部标准的保留时间、质量精度和信号响应,以评估仪器和方法的性能。

后者的性能评估测试分析工作流程中的损失或错误,确保仪器和方法产生有效的数据。
内部控制在注射过程中的稳定保留时间证明了通过分离和测量进行的样品处理的一致性,而可重复的质量精度和稳定的信号响应验证了仪器的可靠性。作为一项额外的质量检查,在整个运行序列中(通常每10-20次注入一次),对所有测试样品的等分样品进行间歇分析。这为整个序列或研究提供了相同样本的可重复测量,并确认了内源性代谢物的稳定信号响应。

HRAM在行动:不全是胎牛 Sera是相似的


对胎牛血清(FBS)批次间生化差异的评估说明了代谢组学分析的力量和良好内控的相关性。FBS通常用作基底细胞培养基的补充物。然而,FBS结构的差异可能导致不一致的细胞培养表型和生长速率。为了确定来源和加工方法是否与FBS批次之间的生化差异相关,分析了来自五个不同国家的四个不同供应商的20个样品,并在制造过程中进行了不同的处理。图3描述了序列运行,包括校准器、混合质量控制样本和测试样本。


图3。FBS研究:样品处理,质量控制(QC)和运行顺序设置。资料来源:赛默飞世尔科学公司


根据图4总结的内部控制交叉运行和交叉注入分析,所采用的方法和HRAM系统表现非常好。所有注入和运行的对照显示,保留时间(A)、质量精度(B)和信号响应(C)的偏差最小。

图4。使用适合用途的HRAM系统实现高质量数据。资料来源:赛默飞世尔科学公司

测试样品代谢组谱的主成分分析将生产过程中透析的FBS批次与热灭活或根本未处理的批次完全分开(图5A)。这些配置文件也根据原产国进行了分组,尽管这些分组并不明显(数据未显示)。

通过反向挖掘获取的数据,我们发现透析后的胎牛血清中尿素的浓度较低(图5B)。尿苷也通过与光谱库的数据匹配进行回顾性鉴定,与来自美国的其他批次相比,尿苷在来自美国的热灭活FBS中更集中(数据未显示)。


图5。通过对采集数据的回溯挖掘,FBS的代谢组学分析揭示了与加工方法相关的成分差异。资料来源:赛默飞世尔科学公司

集中准确性和全面广度


有了自信的化合物鉴定和可靠的定量,HRAM系统擅长于代谢产物的有针对性的分析,并允许数据挖掘发现新的见解,否则会丢失。这种双重分析能力解锁代谢组,以了解生物过程。已知的代谢物构成了表型下生化途径的第一个支架,而回溯挖掘数据填补了空白并揭示了联系。代谢组分析发现的关键是获得代谢组的完整和准确的图像。凭借出色的分辨率和灵活的数据采集,HRAM将这种多样化的分子群体纳入重点。

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