纳米孔测序现在被证明是一个富有成效的领域，以阐明蛋白质，因为它已经在以前的DNA测序。随着重点转向个性化和精准医疗，能够分析个人蛋白质组并提供有洞察力的数据的工具将非常及时。然而，它还没有达到DNA技术所达到的程度，仍然有挑战需要克服，还有谜团需要解决。在这里，我们采访了乔瓦尼·麦格里亚教授(GM)，化学生物学的小组领导格罗宁根大学，介绍他的团队最近在该领域的工作、他们正在努力应对的挑战以及该领域的未来。
克斯:想想那些仍有待解决的挑战，在你的论文你提到在使用生物样品时可能需要预先纯化步骤，蛋白质通过孔的速度太快，无法识别蛋白质测序所需的每种氨基酸。你是否正在纠正这一问题，以便将其用于蛋白质测序?
通用汽车:假设你想识别一个特定的生物标记物，这个特定的生物标记物会给出一个特定的信号，我们知道它是什么，但其他蛋白质可能会给出同样的信号。所以现在的重点是用预纯化步骤将两者分离。这可能是一个相当粗糙的预纯化，因为细微的差异可以被纳米孔识别出来。然而，更重要的是，预纯化步骤会带出所有的目标蛋白质和所有的杂质，这通常是一个问题。我认为我们可以在一些杂质的背景下识别目标，这应该是一个容易处理的问题。但是，要在25 000个潜在目标的背景中确定目标是非常困难的。
不过，最近PLOS One的一项研究表明，使用某种机器学习算法，你也可以研究样本的蛋白质阻断特征作为一个整体，然后你应该能够识别特定的生物标志物。所以，并不是100%确定这是这种方法的一个基本限制。
关于蛋白质通过纳米孔的速度，对于蛋白质测序来说，一个挑战——还有很多挑战——是你首先需要找到一种方法，以恒定的速度和恒定的应用电位在纳米孔中运输多肽。多肽带正电荷和负电荷，所以你不能仅仅用电场来驱动穿过纳米孔的运输。我们解决了在纳米孔中以固定电位运输多肽的问题，方法是在孔和溶液中确定一组条件，允许在纳米孔中以固定电位产生强大的水流，从而克服排斥电场势。
在纳米孔中使用带有许多负电荷的纳米孔，可以获得穿过纳米孔的强水流。在外部电位作用下，正的反离子从纳米孔中流出，产生强烈的单向水流。然后，通过简单地改变溶液的pH值，肽的负电荷(它反对进入带负电荷的纳米孔)就减弱了。换句话说，我们在纳米孔和蛋白质之间找到了适当的平衡，纳米孔具有足够的电荷以促进分析物的进入，而蛋白质具有足够的负电荷以进入纳米孔。
我们需要克服的第二个挑战是观察不同的多肽在穿过纳米孔时是否会发出不同的信号。不同的DNA碱基有不同的信号，但蛋白质的信号是否相同并不明显。人们并不真正知道为什么不同的分子在纳米孔中发出不同的信号，因为纳米孔电流分子识别的分子基础还不清楚。
为了测试这个系统，我们选择了一种多肽，它能给我们一个良好的信号，然后选择另一种多肽，它几乎相同，但只有一个氨基酸不同，我们发现我们可以获得两种不同的信号。这是非常重要的，因为它告诉我们两个只有一个氨基酸不同的分子是可以被区分的。
通过蛋白质测序，控制穿过纳米孔的运输可能更具挑战性，但与DNA测序相比，也有某些事情更容易。例如，我们从基因组分析中知道了蛋白质的序列，所以你真的不需要对所有不同的氨基酸进行排序。你可以对5到6种氨基酸进行排序，然后通过与蛋白质组中已知的蛋白质序列进行比较，你仍然可以识别样本中的蛋白质。
第三部分，即如何控制穿过纳米孔的传输，这不是我们在这项工作中要解决的问题。当然，我们现在正在研究不同种类的分子机器，可以让这种情况发生。对于蛋白质来说，这很困难，因为需要展开多肽链，所以还有待观察你能在多大程度上控制通过纳米孔的运输。然而，正如我之前所说的，因为你不需要对每一个氨基酸进行测序来识别一个蛋白质，这可能意味着仅仅粗略地阅读一个未折叠的蛋白质就足以让你追溯蛋白质的序列。
KS:发表的研究使用了1-25 kDa的蛋白质，但与自然界中发现的许多蛋白质和人类体内的平均蛋白质相比，25 kDa相对较小。扩大生产更大的蛋白质会有问题吗?
通用汽车:理论上，你只需要一个更大的纳米孔。在这里，限制可能是你有多少大的生物纳米孔。好在我的同事们已经做了很多关于固态纳米孔的研究。固态纳米孔使用的是基于硅的人造膜，而不是使用生物膜和蛋白质在上面打孔。它可以很薄，只有几纳米，他们用不同的方法钻出他们想要的大小的洞。
以目前的技术，它在纳米尺度上工作得很好，但在亚纳米尺度上就不那么好了。所以，如果你想要5-10纳米的东西来研究更大的蛋白质，你可以有一个相当可重复的固态纳米孔。
这里的挑战在于创造一种能够捕获蛋白质的形状，因为蛋白质进入孔隙后必须在孔隙中停留足够长的时间才能进行采样。我们使用的生物孔，有一个锥形，其中有一个大的入口和一个狭窄的出口，所以蛋白质可以进入并被困在狭窄的出口。因为蛋白质看到了另一种蛋白质，它们不会展开，而是一直折叠在纳米孔内。这是分析物和孔隙之间的软交互作用。
我想说的是，对于固态孔隙，还有待观察是否可以重建相同的形状和环境，以控制孔隙内蛋白质的持久性，以及孔隙内的蛋白质是否能保持一种形状，使其能够被可靠地识别。
克斯:展望未来，你认为我们距离像现在的DNA那样快速有效地测序一个人的蛋白质组有多远?
通用汽车:这很难说。过去的DNA测序经验表明，你只需要一些突破。然而，你不知道这样的突破何时会发生。它们可能需要一年、两年或几十年的时间。然而，蛋白质分析不同于DNA分析。DNA需要测序，就是这样。你可以绘制一点DNA，这可能是中间步骤，但对于蛋白质，我们有更多的中间步骤。你可以识别一种蛋白质，你可以在其他蛋白质的背景中感知一种特定的蛋白质，你可以为一种蛋白质指纹。因为它们的反应性很强，你可以对某些残基进行反应，然后识别蛋白质。或者你可以对蛋白质本身进行排序，一个氨基酸一个氨基酸。
诊断是一回事，例如，只需识别血液中[低丰度]的特定蛋白质，并将其作为与疾病相关的生物标志物。或者你只是想重新排序一个蛋白质，而不是测序并识别蛋白质的序列，而只是识别序列中的几个氨基酸，然后将其与基因组数据匹配。或者从头测序，在没有先验信息的情况下，你只是想知道所有不同的氨基酸。
如果你谈到最后一个，我想说，在我们确定蛋白质测序的日期之前，还有一个关键的因素需要有人证明。这就是，我们能否控制蛋白质在纳米孔中的单向运输，甚至不是一个氨基酸一个氨基酸的运输?多肽链需要通过，而不是返回。我认为这是关键的一步，所以它必须是单向的。如果你能做到这一点，那么我想说，我们对DNA测序的了解还需要几年的时间，甚至更少地依赖于资源和研究人员的数量。
但在有人能证明这种展开的多肽能在纳米孔中单向传输之前，我不认为有可能给它需要多长时间给出一个日期。
Giovanni Maglia教授接受了科技网络科学作家Karen Steward博士的采访。188金宝搏备用
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