西方Blotting的新常态化

western blot应该能告诉你真实的实验条件或样品之间的差异。它是在研究发现和生物制药中检测蛋白质的工具。但西方的印迹也能骗过你。样品制备、加载或凝胶转移过程中的不一致可能会使结果偏离正规化。研究人员使用归一化来控制这些实验误差的影响，并确保来自印迹的蛋白质数量反映了生物学。

新的标准化技术使研究人员比以往任何时候都更容易纠正数据点之间的方差。一种不太为人所知的技术，称为总蛋白归一化(TPN)，是研究人员确保数据足够可靠的一种方法，可以在样本之间进行忠实的比较，并得出结论。与上一代技术相比，TPN取得了一些关键的进步，使研究人员节省了时间并提高了产量。

在这篇文章中，我们将解释两种主要的西方印迹归一化方法;旧的家政蛋白质法和新的TPN法。

30多年来，研究人员一直使用家政蛋白(HKPs)如GAPDH、肌动蛋白和微管蛋白作为内部负荷控制。HKPs可用于可靠地量化西方印迹，但仅在某些情况下。

HKPs只有在表达式不变的情况下才有效。然而，研究继续表明，HKP的表达可以随着实验条件的变化而变化。^{1 - 4}这是HKP的一个显著缺点，因为研究人员需要花费时间和资源来检查在实验变量范围内的HKP水平(例如，治疗类型，组织类型)，并确认蛋白质水平保持不变。

HKPs的另一个缺点是它们通常以饱和水平存在，导致错误的定量。这是因为检测低丰度靶蛋白通常需要高裂解物负荷，而HKPs通常以高丰度表达。因此，必须确定HKP的线性工作范围。必须在印迹上加载不同的量，以确定产生HKP线性比例信号的样本范围。

HKP检测也很耗时。除了上述一系列测试外，使用HKPs的过程还需要在目标蛋白被探测后剥离膜，并用hkp特异性抗体重新探测。这一过程也引入了结果的可变性。

无污渍总蛋白归一化:一种更简单、更可靠的HKPs替代方案

在过去的十年中，研究人员已经转向TPN，以寻求一种更好的方法来量化蛋白质表达。在TPN中，western blot数据使用样本中的总蛋白进行分析，因此归一化不依赖于单个HKP。该方法比基于hkp的归一化方法更快、更准确、更可靠。

测量印迹或凝胶中总蛋白质的最佳方法是使用无污渍技术。例如，与Ponceau S染色不同，无染色技术随着时间的推移保持其强度，并且不牺牲可重复性。它也不需要像考马斯蓝那样运行重复的样本。无污渍技术使用了一种专有的凝胶化学物质，使用任何无污渍的成像仪都可以在不到五分钟的时间内实现可视化。无染色TPN也不需要大量优化:不需要用抗体探测印迹，也不需要在成像前进行染色和去色步骤。无污渍的方法不会干扰下游应用，如western blotting或质谱分析，因此不需要重复运行。因此，无染色的蛋白质可视化方法优于大多数基于染料的TPN方法，因为它增加了灵敏度，降低了现有工作流程的复杂性，节省了研究人员的时间。

这种无污渍技术依赖于丙烯酰胺凝胶中的三晕化合物和蛋白质上的色氨酸残基之间的紫外线介导反应，从而产生荧光。它能够可靠地检测任何含有色氨酸的蛋白质，这适用于大多数积极研究的蛋白质(表1)。⁵对于色氨酸含量低的蛋白质，只需再增加几秒钟的曝光时间就能改善信号。⁶灵敏度也是无污渍技术的一个重要方面，该技术在典型样品负载(10至50µg蛋白质)中显示线性信号，检测低至0.2至5 ng，这优于科西蓝，与银污渍相当(图1)。⁷

药物发现和开发方面的技术进步要求提高产量，并利用高效时间流程来节约资源和降低成本。无污渍技术能够快速检查凝胶和膜，这意味着科学家可以监控整个western blotting工作流程中的关键检查点，包括在blotting之前SDS-PAGE分离的质量以及转移效率。对于药物发现和开发的研究人员来说，无污渍凝胶可以在30分钟内快速准确地提供样品纯度的视觉确认和纯化工作流程的产量。⁸

结论

由于与HKP归一化相关的可重复性挑战，TPN最近已成为western blot归一化的首选方法，如生物化学杂志．特别是，截至2017年12月，无污渍TPN已经出现在约900篇学术论文中，距离它推出只有5年时间。⁹不依赖HKPs进行western blot定量是对传统方法的突破，但无染色TPN被证明是一种更可靠和准确的方法。随着越来越多的研究人员采用无染色TPN，人们将恢复对western blots定量能力的信心。

作者Kenneth Oh博士，Bio-Rad实验室蛋白质定量组合作、应用和新技术产品经理