了解单细胞测序，其工作原理及其应用

对核酸分子(如DNA或RNA)进行测序，可以获得其核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤)顺序的信息，这些信息提供了生命所需的遗传指令。测序技术的发展源于沃特菲尔，弗雷德里克·桑格而且雷吴20世纪70年代。¹在几十年的时间里，最初用于核酸测序的方法和技术经历了一个陡峭的发展:从读取单个RNA分子，到对整个生物体的基因组进行测序成为可能。²第一份人类基因组草案于2001年在人类基因组计划中发表^3.两年后完工。

上世纪90年代末，商用DNA测序仪首次问世。他们被命名为第二代或新一代测序仪为了将它们与第一批实验性的区分开来，并对整个基因组进行测序。在接下来的20年里，测序仪经历了快速的发展，在不同程度上优化了速度、准确度、测序深度和读取长度等参数。⁴针对特定的应用，已经开发了多种测序方法。虽然相对较新，但最有趣的是单细胞测序。本文将探讨这项技术是如何工作的，以及它告诉我们什么。

什么是单细胞测序，什么是单细胞RNA测序?

传统的下一代测序(NGS)检查一个细胞群的基因组，如细胞培养组织、器官或整个有机体。它的输出是细胞群的“平均基因组”。另一方面，单细胞测序测量细胞群中单个细胞的基因组。⁵现在，传统的方法被称为散装测序以区别于单细胞技术。

单细胞测序技术目前可以用于测量群体中每个细胞的基因组(scDNA-seq)、dna -甲基组或转录组(scRNA-seq)。这些技术已被用于识别癌细胞中的新突变，探索胚胎发育期间发生的渐进表观基因组变异，并评估看似同质的细胞群如何表达特定基因(图1)。⁶

图1: 使用单细胞测序技术，我们可以在看似同质的细胞群中识别新的亚群或细胞状态。A)显示细胞群可能表现出异质性的不同方式。B)显示如何在群体中识别和表征细胞类型。

单细胞测序是如何工作的?

所有单细胞测序技术都需要四个主要步骤(图2):

1)从细胞群中分离出单个细胞。

2)每个分离细胞遗传物质的提取、加工和扩增。

3)制备“测序文库”，包括分离细胞的遗传物质。

4)使用下一代测序仪对文库进行测序。

图2: 单细胞测序流程。 根据感兴趣的遗传物质，样品制备过程略有不同。然而，在所有情况下，所得到的测序材料都是每个细胞的条形码DNA或cDNA库，然后可以在选定的测序平台上进行测序。

细胞分离和基本样品处理

细胞可以用不同的方法分离，^7，8选择哪种主要取决于样品的性质以及细胞分离后所需的处理步骤。每个方法的性能是由它的效率(单位时间内可以分离出多少个细胞)，纯度(收集到的靶细胞的比例)和复苏(收集到的靶细胞与最初可用的靶细胞总数的比例)。让我们考虑一下最常用的技术。⁹

• 荧光激活细胞分选涉及标记细胞选择所基于的细胞蛋白，荧光分子附着在目标特异性抗体上。细胞内的标记物可以通过细胞渗透来获取。因此，该技术允许基于多个参数选择单元格。然而，FACS需要>万个起始细胞，快速流动可能会损害细胞的生存能力。⁷
• 磁激活细胞分选(MACS)利用抗体介导的超顺磁性纳米颗粒标记靶细胞上的特定蛋白质。然而，这意味着，与FACS不同，只有细胞表面分子可以用作标记活细胞的靶标。¹⁰然后使用外部磁场隔离标记细胞，而其他细胞则被冲走。因此，MACS分离物的纯度取决于用于标记的抗体的特异性和亲和力。
• 激光捕获显微解剖(LCM)使用激光从放置在显微镜载玻片上的固体组织样本中分离靶细胞。分离可以通过两种方式完成:直接，当红外光将激光能量转移到只与靶细胞特异性结合的可热性聚合物上;间接地，当紫外线烧蚀细胞。与FACS和MACS不同，LCM可用于完整的组织。它还快速可靠。然而，LCM需要通过视觉检查其形态来识别靶细胞。此外，细胞在分离过程中可能会被切割，紫外线可能会破坏DNA和RNA分子。¹¹
• 最后,手动拾取单元格,或精密控制，需要倒置显微镜结合微量移液管来选择和分离靶细胞。微操作已用于活培养和胚胎细胞。然而，它的通量是有限的，与LCM一样，该技术需要熟练的专业人员正确识别目标细胞。¹²

在进行文库制备之前，评估细胞分离的质量，并通过成像评估细胞的生存能力。RNA完整性也可以评估，这对scRNA-seq分析尤其重要。分离的细胞然后被裂解。感兴趣的遗传物质(DNA或RNA)被分离和扩增，以提供足够的后续检测，因为单细胞通常只产生少量的DNA或RNA。这些步骤的结果材料是单链DNA，即使是用于scRNA-seq分析，如下一节所述。已经制定了一些方案来处理特定研究的要求和限制，例如可用细胞数量较少。¹³

测序文库制备

要对扩增的DNA进行测序，首先需要将其放入测序文库。^13，14测序文库是来自一个细胞群的单链DNA片段的集合，或者在单细胞测序的情况下，来自一个特定的细胞。扩增后，DNA片段被唯一编码，以识别它们属于哪个起始细胞，并在5 '和3 '端添加特定的适配器序列。在这一点上，需要测序的DNA部分通常被命名插入．条形码和适配器在插入件的一端或两端加帽。所有属于同一测序库的DNA片段都使用相同的寡核苷酸序列进行条形码。这允许在相同的排序运行期间对不同库的池进行排序。适配器是平台相关的，需要对片段进行排序。商业试剂盒可用于所有样品和库的准备步骤。为了确保生成的库准确地再现原始单元的状态，描述了几个质量控制(图3)。¹⁵

图3: 用于评估文库制备和测序结果的质量控制。在本例中，单细胞已被FACS分离。

测序

各种商业上可用的测序平台开发的方法略有不同。在这里，我们重点介绍了合成测序方法，包括变种如焦磷酸测序以及可逆终止子测序。在测序之前，一个扩增步骤通常会产生一组DNA片段克隆(通常通过桥式扩增或乳液聚合酶链反应)。由于每组克隆在测序过程中发出相同的信号，因此产生的簇或井信号足够强，可以检测到。¹⁶这种类型的测序通常发生在芯片中，其中可能包含微井。适配器和其他分子，如聚合酶，被绑定到芯片(或微井的底部)，并与连接到插入的适配器相互作用。插入测序需要多个复制步骤，由聚合酶执行，并使用荧光标记的核苷酸。在每个周期中，添加单个荧光标记的核苷酸，如果由聚合酶合并，则触发特定核苷酸的特征发光。在下一个循环开始之前，所有碎片同时发出的光谱通过相机记录下来。当每个核苷酸发出不同的光时，测序仪就会循环地重建所有插入的序列。排序器还读取插入物的标签，将每个测量值分配到相应的库中。

质子检测测序采用不同的合成排序方法。碎片通常与珠子结合并放大以覆盖每个珠子(类似于焦磷酸测序)。然而，当在测序过程中添加碱基时，它释放的不是荧光标签和光释放，而是一个质子，然后可以检测和记录。

另一种不太常见的测序方法是结扎测序．这种方法使用DNA连接酶而不是DNA聚合酶，后者连接荧光标记的短序列而不是核苷酸。在测序之前，DNA片段通常使用乳液PCR扩增化学方法扩增。由于插入物的每个核苷酸被测序两次，这种方法提供了非常准确的读数。然而，通过结扎测序只输出更短的读取，并且与回文序列不兼容。

单细胞测序的类型

单细胞测序技术可以测量不同类型的遗传物质- - - - - -基因组，转录组或甲基组- - - - - -一个细胞。本节解释了样品制备的主要差异(图2)和这三种测序亚型的最相关应用。

单细胞基因组测序

通过确定单个细胞的基因组，scDNA-seq允许研究细胞群体的基因组异质性。¹⁷因此，它主要用于研究微生物群和癌症。微生物群落是单细胞生物的群落，sbet188真人cDNA-seq可以测量其微生物组分的基因组，而不需要首先分离和培养它们。测序数据可以用于研究微生物组的组成，从而研究其生态学、进化和变化。^18，19在癌症研究中，scDNA-seq被用于研究肿瘤内的遗传异质性或识别新的致癌突变。^20.，21由于这些创新能力，scDNA-seq极大地促进了精准医学的发展。²²

对于scDNA-seq，从离体细胞中提取的DNA最常使用多次置换扩增(MDA)或多次退火和环基扩增循环(MALBAC)进行扩增。²³MDA允许快速扩增少量的DNA，提供了一个优秀但不均匀的基因组覆盖。另一方面，MALBAC提供了一个减少但更均匀的基因组覆盖，因此更适合检测拷贝数变异。如前所述，文库由扩增的DNA生成。要使这种方法成功，均匀有效的放大是至关重要的。然而，没有一种放大方法是完美的。特别是，检测单核苷酸多态性(SNPs)和拷贝数变异通常是非常低效的。因此发展了不同的扩增方法来改进特定突变类型的检测。²⁴

单细胞转录组测序(单细胞RNA测序，单细胞RNA-seq或scRNA seq)

scRNA-seq测量给定样本中每个细胞内的RNA分子。这些信息提供了采集细胞时转录组(被转录的基因)的快照。^25，26自开发以来，scRNA-seq已经发现了各种各样的应用。虽然基因表达的最终产物是蛋白质，但检测其信使RNA (mRNA)表明该基因已被打开，因此有可能随后被翻译和表达。此外，共转录基因可以用来推断特定细胞表型的基因调控网络。²⁷一个细胞群体的转录差异可以帮助识别亚群体，如肿瘤肿块的恶性细胞。²⁸scRNA-seq也用于研究重要的基因转录特征，如剪接模式和单等位基因转录。^29，30.由于细菌细胞中低mRNA拷贝数和RNA不稳定性等因素，原核生物scRNA-seq一直存在问题。然而，克服这些问题的方法正在变得可用。^31，32

分离的细胞被裂解，它们的mRNA分子被聚腺苷酸化，用聚[T]-引物富集。这是至关重要的一步，因为细胞中的大多数RNA分子都是核糖体(rRNA):非常大，通常不是转录组测序的目标。接下来，逆转录酶将聚[T]引物的单链mrna转化为互补DNA (cDNA)。PCR或在体外然后使用转录(IVT)来扩增cDNA分子。最后，将条形码标签和测序平台所需的其他短序列添加到cDNA分子中。²⁶

该技术的测序质量受到几个因素的影响，主要的因素是可以从细胞群中获得的库的总数和检测到的读数。细胞的理想数量取决于不同细胞亚群或状态的预期数量。读取的数量表明转录组的测序深度，取决于基因组的大小:读取深度越高，提供的细节就越可靠。样品和库的制备方案也影响结果的质量。

单细胞DNA甲基化测序

DNA甲基化包括甲基转移到胞嘧啶碳上(通常是C5)。甲基化是一种表观遗传机制，它改变DNA的活性而不影响其序列:当在基因启动子中，DNA甲基化通常会抑制基因的转录。³³因此，单细胞DNA甲基化组测序(scDNA-Met-seq)可以用于研究基因相同的细胞群中的表观遗传变化，从而产生不同的表型。DNA甲基化对细胞身份也是必不可少的，是x染色体失活、基因组印迹、转座因子抑制、衰老和致癌的关键。这项技术主要用于发育研究，³⁴但也被用于探索罕见和极其活跃的肿瘤细胞亚群。³⁵

scDNA-Met-seq的样品和文库制备与scDNA-seq相似，只是多了一个步骤。在扩增之前，DNA经历亚硫酸氢盐转化，只将非甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，不影响5-甲基胞嘧啶残基。³⁶然而，亚硫酸氢盐处理倾向于片段化和降解DNA。其他方法，如甲基化敏感限制性内切酶，已被探索，但仍不可用于单细胞测序。

分析单细胞测序数据

测序仪的最终原始输出首先在测序机中直接处理，返回二进制基调用(BCL)文件和质量分数。BCL文件是二进制格式的原始测序输出。为了进一步分析，然后将BCL文件转换为FASTQ文件，FASTQ文件是一个包含序列信息和质量分数的文本文件(图3)。这一步通常是在Linux服务器上使用条形码标记对来自不同库的数据进行多路复用后执行的。

FASTQ文件可以被处理以使序列与模板基因组对齐，注释它们，检测变异，执行差异转录分析和可视化数据。^3.7，3.8一些第三方学术开发的脚本可用于执行这些初步分析。^39，40考虑到FASTQ数据文件的大小(通常每个文件10- 200gb)，这些分析的计算开销很大，因此通常在Linux服务器上使用命令行执行。得到的数据可以使用数据分析和统计工具进一步调查，如数据规范化，主成分分析，t分布随机邻域嵌入分析，聚类分析路径或者基因集富集分析．这些工具在探索大型数据集时很有帮助，因为它们可以识别意想不到的模式和生物行为，以及最显著地驱动特定表型的基因或转录本。特别是,Bioconductor是为R统计编程语言开发的一个杂项包，为基因组学数据分析提供免费的开源软件。⁴¹此包中的工具被设计用于执行上述分析并可视化其结果。某些工作流程和功能已专门优化单细胞测序分析。^42，43

为什么单细胞测序很重要?

组织或器官内的每个细胞都以不同的方式对整个有机体的生理/病理有贡献。有了单细胞技术，我们就可以探测每个细胞并测量其具体贡献对整个细胞群及其有机体或生态系统。这种独特的细节水平是特别有价值在研究稀有细胞或探索相同细胞类型群体中的表型变异时。例如，scRNA-seq已被用于研究罕见的抗原特异性T或B细胞，⁴⁴测量人体微生物群的组成和结构，⁴⁵研究耐药肿瘤亚群的起源和发展，⁴⁶发现植物组织中未知基因的功能，⁴⁷研究肿瘤进展机制，基于肿瘤内细胞异质性预测预后。⁴⁸这些和更多应用由于单细胞测序技术的独特性，已在各个领域成为可能。

将单细胞测序与其他技术和单细胞技术相结合

各种组学技术现在经常结合起来研究单细胞的多层状态。^49，50通过结合前面描述的测序技术，有可能研究同一细胞群中的基因组、表观基因组和转录组景观。^51，52测序技术还经常与蛋白质组学方法结合，包括批量和单细胞，包括代谢组学、磷酸蛋白质组学、乙酰组学和糖蛋白组学。^53，54结合不同的单细胞组学方法，可以更深入地了解细胞群的异质性:可以识别出更多的亚群，因为其他技术可能会发现不同类型的变异。也有可能推断出一种组学技术观察到的变化与另一种组学技术观察到的变化之间的功能联系。这些信息可以帮助确定新的因果关系，从而确定已知表型背后的机制。

已经开发了几种计算方法来整合不同的组学数据集，^55，56包括创新的、基于机器学习的方法。⁵⁷然而，多组学单细胞数据的整合算法往往还不够完善。虽然文库准备协议和测序技术已经大大完善，但数据分析工具仍然落后，现在可能是该领域最大的挑战。

参考文献

1.Jou WM, Haegeman G, Ysebaert M, Fiers W.噬菌体MS2外壳蛋白编码基因的核苷酸序列。自然．1972, 237(5350): 82 - 88。doi:10.1038 / 237082 a0

2.桑格F，航空GM，巴雷尔BG，等。噬菌体的核苷酸序列φX174 DNA。自然．1977, 265(5596): 687 - 695。doi:10.1038 / 265687 a0

3.文特尔JC，亚当斯MD，迈尔斯EW，等。人类基因组序列。科学．2001, 291(5507): 1304 - 1351。doi:10.1126 / science.1058040

4.刘林，李勇，李松，等。下一代测序系统的比较。J Biomed生物技术公司．2012; 2012:1-11。doi:10.1155 / 2012/251364

5.唐旭，黄勇，雷杰，罗辉，朱旭。单细胞测序:新发展及医学应用。细胞Biosci．2019; 9(1): 53。doi:10.1186 / s13578 - 019 - 0314 - y

6.Mannarapu M, Dariya B, Bandapalli OR。单细胞测序技术在胰腺癌中的应用。细胞生物化学．2021, 476(6): 2429 - 2437。doi:10.1007 / s11010 - 021 - 04095 - 4

7.郭志刚，张志刚，张志刚。单细胞分离技术研究进展。Mol科学．2015; 16(8): 16897 - 16919。doi:10.3390 / ijms160816897

8.李志强，李志强，李志强，等。单细胞采集与分析的研究进展。Mol科学．2018; 19(3): 807。doi:10.3390 / ijms19030807

9.胡萍，张伟，辛华，邓刚。单细胞分离与分析。前端细胞开发生物学．2016; 4。doi:10.3389 / fcell.2016.00116

10.wezel G, Seitz D, Schuster S.磁激活细胞分选(MACS)可用于建立斑马鱼神经元细胞培养的大规模方法。Sci代表．2015; 5(1): 7959。doi:10.1038 / srep07959

11.Espina V, Wulfkuhle JD, Calvert V，等。Laser-capture显微解剖。Nat Protoc．2006; 1(2): 586 - 603。doi:10.1038 / nprot.2006.85

12.Citri A, Pang ZP, Südhof TC, Wernig M, Malenka RC。单神经元细胞基因表达的qPCR综合分析。Nat Protoc．2012年,7(1):118 - 127。doi:10.1038 / nprot.2011.430

13.Hess JF, Kohl TA, Kotrová M，等。下一代测序库的准备工作:自动化策略综述。Biotechnol副词．2020; 41:107537。doi:10.1016 / j.biotechadv.2020.107537

14.李志强，李志强，李志强，等。新一代测序文库的制备:体外转位同时片段化和标记。Nat方法．2009; 6 (11): i ii。doi:10.1038 / nmeth.f.272

15.张晓明，杨晓明，杨晓明，等。新一代测序技术中的标准化与质量管理。应用翻译基因．2016; 10:2-9。doi:10.1016 / j.atg.2016.06.001

16.彭志强，王志强，王志强，等。测序技术与基因组测序技术。J应用Genet。2011; 52(4): 413 - 435。doi:10.1007 / s13353 - 011 - 0057 - x

17.高德，高华。单细胞基因组测序:科学现状。Nat Rev Genet。2016; 17(3): 175 - 188。doi:10.1038 / nrg.2015.16

18.王志强，王志强，王志强，等。单细胞基因组学揭示了野生原绿球藻中共存的数百个亚群。科学．2014, 344(6182): 416 - 420。doi:10.1126 / science.1248575

19.王丽娟，王丽娟，王丽娟，等。表层海洋浮游细菌普遍存在基因组精简和纬度差异。PNAS．2013; 110(28): 11463 - 11468。doi:10.1073 / pnas.1304246110

20.张玲，董霞，李敏，Maslov AY，王涛，Vijg J.单细胞全基因组测序揭示B淋巴细胞体细胞突变在人类寿命中的功能格局。PNAS．2019; 116(18): 9014 - 9019。doi:10.1073 / pnas.1902510116

21.Francis JM, Zhang CZ, Maire CL，等。通过单核测序解决胶质母细胞瘤中的EGFR变异异质性。癌症越是加大．2014; 4(8): 956 - 971。doi:2159 - 8290. - 10.1158 / cd - 13 - 0879

22.李志强，李志强，李志强，韩华。单细胞测序技术在精准医学中的应用。癌症治疗方案．在线发布2019:237-252。doi:10.1007 / 978 - 3 - 030 - 16391 - 4 - _9

23.陈敏，宋鹏，邹东，等。单细胞测序中多重置换扩增(MDA)与多重退火和环基扩增循环(MALBAC)的比较。《公共科学图书馆•综合》．2014; 9 (12): e114520。doi:10.1371 / journal.pone.0114520

24.崔锋，苏娟，陶x, Northrop LE, Scott RT.单细胞全基因组扩增技术影响基于SNP微阵列的基因分型和拷贝数分析的准确性。基础科学生殖医学。2011; 17(6): 335 - 343。doi:10.1093 / molehr / gaq103

25.Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA。单细胞RNA测序技术和生物学。摩尔细胞．58 2015;(4): 610 - 620。doi:10.1016 / j.molcel.2015.04.005

26.Haque A, Engel J, Teichmann SA, Lönnberg T.生物医学研究和临床应用的单细胞rna测序实用指南。基因组医学．2017; 9(1): 75。doi:10.1186 / s13073 - 017 - 0467 - 4

27.李志刚，李志刚，李志刚。利用单细胞基因组学研究细胞特性的载体。生物科技Nat》．2016年,34(11):1145 - 1160。doi:10.1038 / nbt.3711

28.泰鲁什I，伊扎尔B，普拉卡丹SM，等。通过单细胞RNA-seq分析转移性黑色素瘤的多细胞生态系统。科学．2016, 352(6282): 189 - 196。doi:10.1126 / science.aad0501

29.张晓明，王晓明，张晓明，等。单细胞转录组学揭示了免疫细胞表达和剪接的双态性。自然．2013, 498(7453): 236 - 240。doi:10.1038 / nature12172

30.邓琪，Ramsköld D, Reinius B, Sandberg R.单细胞RNA-seq揭示哺乳动物细胞中动态、随机单等位基因表达。科学．2014, 343(6167): 193 - 196。doi:10.1126 / science.1245316

31.Imdahl F, Vafadarnejad E, Homberger C, Saliba A-E, Vogel J。单细胞rna测序报告单个细菌的生长条件特异性全局转录组。Nat Microbiol．2020; 5(10): 1202 - 1206。doi:10.1038 / s41564 - 020 - 0774 - 1

32.Kuchina A, Brettner LM, Paleologu L，等。微生物单细胞RNA的分裂池条形码测序。科学．2021, 371 (6531): eaba5257。doi:10.1126 / science.aba5257

33.Moore LD, Le T, Fan G. DNA甲基化及其基本功能。神经精神药理学．2013年,38(1):政府。doi:10.1038 / npp.2012.112

34.朱鹏，郭华，任勇，等。人类植入前胚胎的单细胞DNA甲基化组测序。Nat麝猫．2018; 50(1): 19。doi:10.1038 / s41588 - 017 - 0007 - 6

35.郭建军，王志强，王志强，等。循环肿瘤细胞聚集形成DNA甲基化，使转移播撒成为可能。细胞．2019, 176 (2): 98 - 112. - e14灯头。doi:10.1016 / j.cell.2018.11.046

36.李海燕，李志强，李志强，等。评估表观遗传异质性的单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序。Nat方法．2014; 11(8): 817 - 820。doi:10.1038 / nmeth.3035

37.杜宾A，戴维斯CA，施莱辛格F，等。STAR:超快通用RNA-seq对准器。生物信息学．2013; 29(1): 15至21。doi:10.1093 /生物信息学/ bts635

38.特拉普内尔，罗伯茨A，高夫L，等。TopHat和Cufflinks RNA-seq实验的差异基因和转录本表达分析。Nat Protoc．2012; 7(3): 562 - 578。doi:10.1038 / nprot.2012.016

39.Bray NL, Pimentel H, Melsted P, Pachter L.近最优概率rna序列定量。生物科技Nat》。2016年,34(5):525 - 527。doi:10.1038 / nbt.3519

40.张志刚，李志刚，张志刚，等。SPAdes:一种新的基因组组装算法及其在单细胞测序中的应用。计算生物学．2012; 19(5): 455 - 477。doi:10.1089 / cmb.2012.0021

41.胡伯伟，杨晓明，Pagès，等。用于计算和注释基因组范围的软件。PLoS计算生物学．2013; 9 (8): e1003118。doi:10.1371 / journal.pcbi.1003118

42.李志强，李志强，李志强，等。与Bioconductor协调单细胞分析。Nat方法．2020年,17(2):137 - 145。doi:10.1038 / s41592 - 019 - 0654 - x

43.Perraudeau F, Risso D, Street K, Purdom E, Dudoit S.单细胞RNA测序的生物传导工作流程:归一化，降维，聚类和谱系推断。F1000Research。2017; 6:1158。doi:10.12688 / f1000research.12122.1

44.张晓明，王晓明，张晓明，等。单细胞转录组学揭示了免疫细胞表达和剪接的双态性。自然．2013, 498(7453): 236 - 240。doi:10.1038 / nature12172

45.Balachandran M, Cross KL, Podar M.单细胞基因组学和口腔微生物组。登特保留区。2020, 99(6): 613 - 620。doi:10.1177 / 0022034520907380

46.金晨，高锐，世娥，等。单细胞测序显示三阴性乳腺癌的耐药演变。细胞．2018, 173 (4): 879 - 893. - e13。doi:10.1016 / j.cell.2018.03.041

47.王志强，杨波，王志强，等。维管转录因子引导植物表皮对限制性磷酸盐条件的反应。科学．2020, 370(6518)。doi:10.1126 / science.aay4970

48.Patel AP, Tirosh I, Trombetta JJ，等。单细胞RNA-seq在原发性胶质母细胞瘤中显示瘤内异质性。科学．2014, 344(6190): 1396 - 1401。doi:10.1126 / science.1254257

49.李建平，陈世峰，苏晓峰，等。成人大脑转录和表观遗传状态的综合单细胞分析。生物科技Nat》．2018年,36(1):70 - 80。doi:10.1038 / nbt.4038

50.葛兰佳，李志强，李志强，等。单细胞多组分析鉴定混合表型急性白血病的调控程序。生物科技Nat》．2019年,37(12):1458 - 1465。doi:10.1038 / s41587 - 019 - 0332 - 7

51.kasima Y, Sakamoto Y, Kaneko K, Seki M, Suzuki Y, Suzuki A.单细胞测序技术从个体到多组学分析。Exp Mol医学．2020; 52(9): 1419 - 1427。doi:10.1038 / s12276 - 020 - 00499 - 2

52.李俊，黄东。单细胞多组学技术与数据分析方法。Exp Mol医学．2020; 52(9): 1428 - 1442。doi:10.1038 / s12276 - 020 - 0420 - 2

53.Angelidis I, Simon LM, Fernandez IE，等。由单细胞转录组学和深层组织蛋白质组学绘制的衰老肺图谱．Nat Commun．2019; 10(1): 963。doi:10.1038 / s41467 - 019 - 08831 - 9

54.朱杨，谢宾格M，埃尔旺格DC，等。单细胞蛋白质组学揭示了毛细胞发育过程中表达的变化。eLife．2019年,8。doi:10.7554 / eLife.50777

55.李志强，李志强，等。单细胞数据的全面集成。细胞．2019, 177 (7): 1888 - 1902. - e21。doi:10.1016 / j.cell.2019.05.031

56.韦尔奇JD, Kozareva V, Ferreira A, Vanderburg C, Martin C, Macosko EZ。单细胞多组集成比较和对比脑细胞的特征。细胞．2019, 177 (7): 1873 - 1887. - e17。doi:10.1016 / j.cell.2019.05.00657.Erfanian N, Heydari AA, Iañez P，等。深度学习在单细胞组学数据分析中的应用。bioRxiv。发布日期:2021年1月1日。doi:10.1101 / 2021.11.26.470166