面对比较纠结境地中的利弊:没有定量蛋白质组学生活质吗?

在蛋白质组学的早期开始,有压倒性的程度的兴奋和热情为生物学和质谱能做什么整个科学界。初始出版物主要集中在确定蛋白质的“数字”,很少有人注意到确定变更的蛋白质数量在特定的实验条件下,例如,扰动与药物或生长因子的刺激。一种技术,使同时许多蛋白质的分离和定量,但是二维凝胶电泳(2 de)¹。这里,定量是通过比较分析两个或两个以上的凝胶之间的蛋白质染色,细胞的代表来自不同的州/治疗。随后,感兴趣的蛋白质凝胶点被质谱鉴定。2 de的缺点是,这项技术是非常挑剔的丰富的蛋白质和low-abundance调节蛋白的检测,如激酶和转录因子,是有限的²。

在最初的兴奋在蛋白质组学通过的可能性,许多生物学家和大规模spectrometrists都后退一步,反映。会更有意义不仅正确识别的蛋白质样品中也添加一个定量组件每一个和每一个蛋白质被确认吗?事实上,质疑,这种模式的出现和最终验收是社区的欢迎;和成功耦合nano-high液相色谱(nano-HPLC) nano-electrospray电离串联质谱(nanoESI-MS / MS),来定量的时代液相色谱质谱分析(质)。当被问及他的意见为什么这个科学领域广泛的重要和关键人员,迈克尔·j·McCoss华盛顿大学基因组科学教授回答,“这是一个领域,从测量中使用药物的滥用,药效学,蛋白质组学,代谢组学,环境污染物,新生儿筛查,维生素D,取证,等。“这样一个显著的多样性的应用确保了的技术发展和普遍接受的量化质已经成为不可或缺的日常研究科学家。特别是对蛋白质组学应用,教授Bernhard工业,椅子上的蛋白质组学和Bioanalytics慕尼黑工业大学指出,”在蛋白质组学定量测量是重要的这些援助在客观地分析一个系统(生物)”。

我怎么能量化蛋白质吗?

定量质可用的技术主要分为两类:(i)相对定量;和(2)确定合成肽由校准丰富稳定isotope-labeled标准(图1)。目前,大多数科学界应用前的方法来研究问题。然而,后者正开始发挥重要作用密切;特别是在临床应用。

基于探索相对定量质使得研究人员同时确定跨多个样品蛋白质丰度的变化。 Bernhard工业说,“但是尤其强烈,它可以量化很多蛋白质并行,而无需知道先天的蛋白质一个可能需要分析吗 ”。 真正掌握一个人的功能蛋白质和蛋白质的关系与他人在一个复杂的生物系统,改变蛋白质丰度相对于基线或标准的系统必须测量。顾名思义,相对定量涉及大量的蛋白质对指定条件的比较,即。多少的肽(外推,一种蛋白质)是在条件B, C, D等。数量相同的肽的条件相比a .昆明理工还指出,“ 质也是强大的,可以开发定量分析蛋白质的抗体存在或者是质量差”。

更广泛的来说,基本上有两种方法供质蛋白质相对定量。这些都是:(i)标记;和(2)label-free。前者类别分为两个标记多肽/蛋白质蛋白质组的方法。即通过代谢标记,最初在1999年首创³后来更广泛的采用研究团体的形式SILAC (年代表我sotopel亚伯与一个米诺酸在c魔法文化)⁴。蛋白质也可以修改已包含化学衍生化等方法我sotope -c欧迪一个ffinitytags (ICAT)⁵,¹⁸O标记⁶、二甲基标签⁷等压质量标签,即。,tandem米屁股tag (TMT)和我sobarictag)为r从格和一个大堡问uantitation (iTRAQ)^8、9。

SILAC,生物样品标签在体外与目标氨基酸的重同位素版本。在蛋白质合成过程中,自然形成的氨基酸被重标记版本。细胞暴露于不同的实验条件(培养在轻型、中型、重型媒体)可以混合和处理步骤进行合并后的样本(图1中,代谢标记)。这种策略显著减少了样品制备过程中可能发生的任何变化和更准确的定量有明显的优势。与如。、TMT试剂⁸,可以实现高通量复合蛋白定量。当结合质和蛋白质组数据的软件,目前,多达16个不同的样本来自细胞,组织或生物体液可以同时分析多肽/蛋白质识别,和多肽/蛋白质的相对数量计算(图1中,化学标签)。

Label-free定量,但是最近人气复苏。这个新的兴趣来自社区的主要发达国家由于改进质量解决当前的质谱仪,改善与新的高效液相色谱保留时间稳定系统和改进的数据分析算法,不仅使多个色谱跟踪;但也可以提取大量的痕迹特征。同时,data-independent收购(DIA)也成为一种强大的方法来深,label-free相对整个蛋白质组蛋白定量。总的来说,label-free定量方法是一个非常具有成本效益的替代SILAC和TMT的主要优势是跨多个样本比较蛋白质丰度变化不使用任何同位素标签。但是有的样品分别进行了分析;非常有利的一个方面分析组成的军团甚至成千上万的患者样本。使用复杂的软件算法,现在更容易集成信号对应于独特的肽离子在整个信用证的时间尺度。Post-LC-MS采集的数据,个人分析可以比较和色谱特性共同所有的样品都可以一致(图1中,标签免费)。蛋白质组的主要优势被label-free质定量比较的能力无限数量的样品,和昂贵的标签的淘汰策略。 A major disadvantage, however, is that there is increased LC-MS acquisition time (as each sample is run consecutively). Nevertheless, new systems are appearing on the market than can provide very rapid and short LC gradients to diminish the time required to analyze thousands of clinical samples.

使用稳定同位素的概念合成肽作为内部标准定量蛋白质的质是首创奥凯达¹⁰ (图1,飙升的标准)。这些合成胰蛋白酶的多肽具有相同的氨基酸序列的自然产生的肽的兴趣。然而,合成肽包含至少一个稳定isotope-labeled氨基酸导致小分子质量增加(6 - 10 Da)。已知的合成肽等效量飙升到蛋白质组学质消化和整个样本分析。原生肽和上升肽标准将色谱co-elute和电离质谱仪。的m / z然而,两个肽可以很容易被认出来。从提取离子色谱图和计算的曲线下的面积缩氨酸,估计量的原生肽可以通过比较峰值比率计算。普遍接受的建议是合成至少三个胰蛋白酶的多肽/蛋白质。如果需要一些蛋白质的定量实验;然而,价格很快升级。此外,尽管肽标准的飙升是相当简单的方法中,肽的校准丰富反映了蛋白质水平仍然是一个挑战¹¹。选择校准方法解决这些困难已经提出,包括,如。使用单点共同参考池^12、13。

我为什么要用数量来表示我的蛋白质?

肽和蛋白质定量理解蛋白质的动力学的核心,尤其是在活跃的不断变化的通量和动态蛋白质组和基本的研究许多关键蛋白质组学领域的意见领袖。Bernhard工业 例行公事地 使用定量质继续他的研究。“我们的目标是 更好地了解癌症药物在肿瘤细胞和工作。为了捕捉分子这些生物系统的复杂性,我们需要技术,可以在一个许多蛋白质定量测量实验和高吞吐量。在这种背景下,我们所有的研究始于质等生物系统为了建立假设可以通过更专业随访实验。“同样,迈克McCoss回声工业的话说,说,“ 我lab.是质实验室。我们所做的一切都围绕着与质进行定量测量。我们绝对没有发明它,但是我们对它,我们经常把它应用到许多不同的应用程序。”

当被问及意识水平的量化质技术被其他科学家, McCoss回答说:“我敢肯定,所有的化学家、生物化学家和细胞生物学家,等。非常熟悉定量质和最有可能受益或依赖于它在某个时间点上。“工业回答一致”,在生命科学的社区,但是作为一个定量的方法是非常著名的;然而,但是作为一个整体仍然不那么经常使用基因技术。这是因为技术还不是那么容易——/普及的科学家。”

定量质是现代蛋白质组学的基础

定量质技术存在和已成为不可或缺的重要组成部分,任何蛋白质组学实验。事实上,定量测量在几乎每一个蛋白质组学研究的核心是今天进行。这推动了发展质和相关样品制备、分离、和数据分析方法,但是现在事实上的标准在蛋白质组学定量测量。McCoss集团,这是不言而喻的,” 我们主要是蛋白质组学实验室浓厚的兴趣开发和应用质谱定量分析的蛋白质。“工业实验室运行相当大质比操作平台由七个系统一天24小时,一周7天。因此,正如工业国家,”的核心技术是每天我们所做的”。此外,“技术继续发展迅速(附带的信息一样)。因此,质非常明亮的观点。需要怎样的技术变得更容易基本生命科学家和临床医生为了使一个更强大的影响,如。,医疗保健行业。”

图1:基于定量质蛋白质组工作流程。蓝色和绿色框表示两个实验条件。水平线表示样本在哪里的总和。虚线显示实验变异和,随后,量化错误可以发生。改编自¹⁴。

引用

1。 p h .奥法雷尔,J。医学杂志。化学。250年,4007 - 4021 (1975)。

2。 s . p . Gygiet al。,摩尔。细胞。医学杂志。19,1720 - 1730 (1999)。

3所示。 y Odaet al。,Proc。国家的。学会科学。美国96年,6591 - 6596 (1999)。

4所示。 s e·昂et al。,摩尔。细胞。蛋白质组学1,376 - 386 (2002)。

5。 s . p . Gygiet al。,Nat。Biotechnol。17,994 - 999 (1999)。

6。 x么et al。,肛交。化学。73年,2836 - 2842 (2001)。

7所示。 j·l·许et al。,肛交。化学。75年,6843 - 6852 (2003)。

8。 a·汤普森et al。,肛交。化学。75年,1895 - 1904 (2003)。

9。 p·l·罗斯et al。,摩尔。细胞。蛋白质组学3,1154 - 1169 (2004)。

10。 d·m·奥和m .凯达生物医学。质量范围。10,471 - 479 (1983)。

11。 c . m .舒福德et al。,肛交。化学。89年,7406 - 7415 (2017)。

12。 r·p·格兰特和a . n . Hoofnagle中国。化学。60,941 - 944 (2014)。

13。 l·k·皮诺et al。,肛交。化学。90年,13112 - 13117 (2018)。

14。 m . Bantscheffet al。,肛交。Bioanal。化学。404年,939 - 965 (2012)。