流式细胞术是什么?gydF4y2Ba

在分析细胞在实验室环境中,流式细胞术是一种广泛使用的和全面的单细胞分析方法。本文概述了流式细胞术是什么,它是如何工作的,不同类型的存在,如何分析数据,以及流式细胞仪的未来。gydF4y2Ba

流式细胞术是什么?gydF4y2Ba

流式细胞术分析细胞技术用于各种各样的用途,包括细胞计数、表现型,细胞周期评估和可行性。激光器产生的光在流式细胞分析仪是分散的细胞样本,通过测量探测器,然后转换成信号,可以分析和测量。gydF4y2Ba

流式细胞术是如何工作的呢?gydF4y2Ba

来gydF4y2Ba开始使用流式细胞仪gydF4y2Ba,第一步是要分析的样品做准备。细胞从gydF4y2Ba细胞培养gydF4y2Ba、血液或分类组织,应暂停。这是分歧几个管细胞悬液gydF4y2Ba染色gydF4y2Ba保留一个整除的清白的细胞作为对照。其他样品是通过增加抗体染色和荧光探针标记,或染料染色细胞组件。首先在分析细胞内蛋白质,细胞必须固定在福尔马林的缓冲和permeabilized (permeabilizing代理)允许抗体和染料进入细胞。与抗体或染料,孵化后细胞洗缓冲区和resuspended saline-based缓冲区进行分析。这个准备样品然后介绍流式细胞分析仪。gydF4y2Ba

在流式细胞分析仪有三个主要组件:gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba应用流体学、光学和电子产品。中部的血细胞计数器-流细胞样品材料满足激发光和散射光,随后被检测系统。gydF4y2Ba

图1:gydF4y2Ba流式细胞术的主要组件。gydF4y2Ba

1。的gydF4y2Ba应用流体学gydF4y2Ba系统包含鞘液(saline-based缓冲区或水)压力通过机器来指导细胞样本过去激光单独测量的每一个细胞。gydF4y2Ba

2。的gydF4y2Ba光学gydF4y2Ba包括激光、发光样品,等集光学、光电倍增管(pmt),收集信号分散的样本。gydF4y2Ba

3所示。最后,血细胞计数器gydF4y2Ba电子产品gydF4y2Ba将检测到的信号转换成数字参数,可以使用软件进行分析。gydF4y2Ba

向前散射,散射和荧光信号?gydF4y2Ba

流式细胞仪的三个主要输出测量散射,散射,和荧光信号。激光的可见光反射每个单元提供一般细胞的大小和形状特征。gydF4y2Ba

图2:gydF4y2Ba向前散射。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba向前散射gydF4y2Ba(FSC)是来自向前散射方向,反映了细胞的大小。激光的散射测量沿着路径和每一个细胞周围的光线弯曲的细胞造成衍射。因此,FSC的强度反映了细胞的直径。gydF4y2Ba

图3:gydF4y2Ba散射。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba边撒gydF4y2Ba(SSC)是激光束的散射测量在90度,反映了粒度或细胞的复杂性。细胞的结构将改变光波的方向进入细胞,导致特定的细胞结构,如颗粒和细胞核,折射光。SSC越激烈,预计更多的折射,粒度的细胞。gydF4y2Ba

图4:gydF4y2Ba 荧光信号。gydF4y2Ba

第三输出测量gydF4y2Ba荧光信号gydF4y2Ba。这光时发出激光激发荧光团。荧光团分子能吸收并回送光激发。光子吸收的激光光源的荧光团的电子,移动到一个更高的能量状态。这些电子然后释放光子的能量回到基态。这些光子的波长是受损失的能量分子相互作用过程中。每个荧光团都有自己的发射光谱可以部分重叠与其他荧光团。荧光体可用于标签抗体,进而可以绑定,从而检测特定抗原或细胞,或可以用作直接染料染色的细胞,例如,通过绑定到DNA。gydF4y2Ba

流式细胞术中使用的是什么工具?gydF4y2Ba

至少,血细胞计数器将包含一个激光器,探测器,和流体系统,确保激光细胞的快速流过去。激光在血细胞计数器的数量和探测器的数量和质量显著增加。这些发展扩大的数量能被探测到的标记。gydF4y2Ba

流血细胞计数器可能是为特定目的而设计的。例如,允许高吞吐量的样品,以及板装入器可能将启用多个样本的快速不干涉分析。gydF4y2Ba

流式细胞仪等仪器的发展gydF4y2Ba

添加到多参数分析和允许更深入的评估,开发了其他类型的血细胞计数器:gydF4y2Ba

质量血细胞计数gydF4y2Ba ^2gydF4y2Ba (飞行时间gydF4y2Ba质谱分析gydF4y2Ba或cyTOF):不是抗体标记荧光团,这种技术使用与重金属离子标记抗体标记。超过100的金属探测器有限的可用信号重叠,允许更高维比传统流式细胞术分析。因此,深入表现型可以用这种技术,执行有用的在免疫学和癌症等研究领域。传统的流式细胞仪的主要区别在于,分析蒸发液滴含有细胞,雾化,流中的电离室,质谱仪检测产生的离子。从样品离子的飞行时间探测器用于分析。gydF4y2Ba

光谱流式细胞术gydF4y2Ba ^3gydF4y2Ba :而不是评估每一个荧光团的峰值发射光谱流式细胞术使用一系列探测器测量每个荧光团的整个频谱。这些光谱分离使用算法。这允许使用荧光团与重叠光谱增加参数的数量在一个实验中分析。gydF4y2Ba

成像血细胞计数gydF4y2Ba ^4gydF4y2Ba :这种类型的血细胞计数结合了传统的流和荧光显微镜。另外的技术允许评估细胞的形态学和蛋白质,可用于可视化co-expression核易位的蛋白质和细胞结合,免疫细胞突触。gydF4y2Ba

细胞分类gydF4y2Ba

fluorescence-activated细胞分选机(流式细胞仪)是一种装置,利用流式细胞仪进行细胞进一步分析或实验gydF4y2Ba ^1gydF4y2Ba 。而不是只测量细胞特征,细胞基于特定的特征选择和引导到收集船舶净化某些细胞类型的示例。流式细胞仪的使用的一个例子是获取T细胞样本的外周血单核细胞(PBMCs)从血液。进一步培养后的细胞通常需要排序,排序至关重要的是,在无菌条件下,执行过程温和,避免破坏细胞和减少他们的生存能力。出于这个原因,细胞分类不能表现在质谱由于破坏的细胞进行分析。可以传统流cytometry-based或spectral-based进行分拣。gydF4y2Ba

在细胞数量上执行排序是积极的还是消极的特定参数。细胞分离使用高频振荡的单个细胞样本液体流创建滴,给出一个积极的还是消极的。水滴然后指向一组船根据他们的费用。gydF4y2Ba

流式细胞仪数据分析吗?gydF4y2Ba

直方图和创建点阴谋gydF4y2Ba流式细胞仪数据gydF4y2Ba收集分析。但首先,有几种处理步骤,应采取使准确的分析。gydF4y2Ba

选择可行的单个细胞gydF4y2Ba

一般来说,一个分析将从单个细胞的选择基于某些感兴趣的特征,这是由一个过程称为浇注。分析软件允许用户在绘制线条的时候,盖茨,在特定的细胞群选择进一步分析。它是至关重要的gydF4y2Ba门在单个细胞gydF4y2Ba作为对比,细胞通过激光的同时,可能导致假阳性信号从一个细胞。FSC和SSC数据,使用点情节显示单个细胞的大小和粒度选择感兴趣的人口进行进一步分析。gydF4y2Ba

此外,它是至关重要的gydF4y2Ba门的可行性gydF4y2Ba,死细胞会释放出更多的自发荧光可能影响分析。自体荧光可以重叠使用的一些荧光团导致假阳性信号。可行性评估使用可行性染料,dna结合蛋白或与自由胺组和反应的细胞。gydF4y2Ba

补偿gydF4y2Ba

下一步的分析是评估特定荧光信号测量每个细胞。有重叠的可用荧光团的发射光谱,实验与多个荧光团可能需要赔偿。gydF4y2Ba ^5gydF4y2Ba 光谱重叠会导致假阳性,被测信号来自另一个荧光团。因此,适当的实验设计是至关重要的构建荧光团面板用最小的光谱重叠。即便如此,校正重叠,或补偿,往往是必需的。积极的和消极的控制样本指导补偿,理想情况下使用研究细胞类型,或者如果这是不可能的,使用补偿珠子。gydF4y2Ba ^5gydF4y2Ba 补偿可以设置在测量或分析。gydF4y2Ba

控制和分析gydF4y2Ba

一旦补偿设置,每一个标记都可以从每个荧光检测通道通过收集分析数据。感兴趣的可以进行额外的控制人口集中在特定参数的存在与否。密度和直方图情节可以用于这一目的。gydF4y2Ba

图5:gydF4y2Ba表示密度图和直方图。gydF4y2Ba

密度图gydF4y2Ba单个细胞显示为一个点分布根据其荧光性质。颜色是用来表示细胞的数量与特征分析。两个标记可以可视化,一个在x轴上,一个在y轴,区分细胞基于这两个参数的表达式。gydF4y2Ba柱状图gydF4y2Ba显示一个参数上的细胞计数并显示轴和轴上的荧光强度。gydF4y2Ba

控制是必不可少的适当的控制,可以设置基于积极的和消极的控制。积极的控制是一个细胞样本表达标记检测到抗体的荧光团的兴趣。消极的控制可能是清白的细胞或细胞染色同形像的控制;抗体标记的荧光团用于分析是针对抗原在细胞不存在,为非特异性背景正确。更大的电池板与许多参数,推荐使用fluorescence-minus-one (FMO)控制。这些控件包括所有荧光标记单个流应该创建面板- 1和每一个荧光标记用于实验。它允许重叠光谱资料的背景信号检测。gydF4y2Ba

高维数据分析gydF4y2Ba

参数的数量的扩张研究改变了流式细胞仪数据进行了分析。添加了每个参数,获得更多维度的数据。因此,发展了新的分析技术从这些高维数据中提取信息。例子包括主成分分析(PCA),gydF4y2Ba ^6gydF4y2Ba 扩充树density-normalized事件的进展分析(铲)gydF4y2Ba ^7gydF4y2Ba 和邻居t-stochastic嵌入(tSNE)算法。gydF4y2Ba ^8gydF4y2Ba 这些算法集群数据基于细胞表型相似性和差异,允许二维分析。gydF4y2Ba

流式细胞术的应用是什么?gydF4y2Ba

流式细胞仪是用于细胞生物学,包括在gydF4y2Ba生物制药的发展和分析gydF4y2Ba,更多的gydF4y2Ba临床gydF4y2Ba应用程序。gydF4y2Ba

细胞生物学的应用程序包括:gydF4y2Ba

一)gydF4y2Ba 细胞countingydF4y2BaggydF4y2Ba

B)gydF4y2Ba细胞周期分析gydF4y2Ba
C)gydF4y2Ba测量的可行性gydF4y2Ba
D)gydF4y2Ba扩散gydF4y2Ba
E)gydF4y2Ba各种细胞类型和随后的细胞的表型出现排序gydF4y2Ba

为gydF4y2Ba(前)临床应用gydF4y2Ba流式细胞仪可用于:gydF4y2Ba

一)gydF4y2Ba 检测各种免疫细胞gydF4y2Ba ^9gydF4y2Ba
B)gydF4y2Ba评估对活化的免疫细胞和细胞因子的生产潜在的对靶细胞反应性gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba
C)gydF4y2Ba深入研究肿瘤细胞和肿瘤细胞微环境gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba
D)gydF4y2Ba检测到病毒感染细胞gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba
E)gydF4y2Ba生育率评估精子的特征分析gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba
F)gydF4y2Ba监测心脏疾病和败血症gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}
G)gydF4y2Ba描述细胞在神经科学的研究gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba

挑战和流式细胞仪的局限性gydF4y2Ba

尽管优势,流式细胞仪可以提供细胞生物学和临床应用,有一些缺点与技术有关。系统中的流体可以挑战保持一致,与细胞或碎片导致封锁或流速的变化影响分析。有特定的风险当大细胞,如癌症细胞,进行了分析。管道的污染可以导致系统被封锁和流中断。激光准直也很有必要,以确保一致的结果,应该定期检查。额外的限制包括血细胞计数器的潜力造成损害细胞,影响排序时分析和后续培养细胞,和单细胞分析无法提供有关组织的信息特征。最后,血细胞计数器的成本和运营成本,尤其是对高参数的设备,可以高,限制了其使用。gydF4y2Ba

流式细胞术的发展未来gydF4y2Ba

在过去的几十年中,主要发展领域允许的数量显著增加参数,可以在每个样本学习和减少这些笨重的机器的大小。这些发展可能会继续在未来几年,只会增加获得数据的复杂性,需要开发软件标准化和验证分析。gydF4y2Ba

进一步发展gydF4y2Ba在这个领域将允许更广泛的分析在更广泛的范围内,增加标记的数量,可以为每个样本分析和先进的数据分析方法,允许大样本大小来详细分析。减少仪器的尺寸将允许更容易放置在实验室的台式和甚至可能使使用在有限的格式。此外,标准化的工作流程将会减少用户出错率和临床和诊断应用程序允许高吞吐量。自动移液,补偿的设置,允许分析自动孔板可以增加流式细胞术分析的可靠性。gydF4y2Ba

术语表gydF4y2Ba

抗体gydF4y2Ba	蛋白质,特别是结合抗原,可以标记荧光团或其他化学物质的检测gydF4y2Ba
自发荧光gydF4y2Ba	自然光线发射单元gydF4y2Ba
补偿gydF4y2Ba	计算将荧光光谱重叠蔓延在多个探测器gydF4y2Ba
补偿珠子gydF4y2Ba	很容易结合抗体的微粒子,可以作为一个积极的控制来确定正确的流式细胞分析仪的设置gydF4y2Ba
密度图gydF4y2Ba	一块中细胞的分布与某些荧光强度提供颜色反映细胞的密度与特征gydF4y2Ba
点的情节gydF4y2Ba	情节的每一个细胞都被表示为一个点gydF4y2Ba
对比gydF4y2Ba	当两个粒子或细胞同时通过激光gydF4y2Ba
流式细胞仪gydF4y2Ba	荧光激活细胞分选仪gydF4y2Ba
荧光团gydF4y2Ba	或荧光染料,荧光化学激光激发后发光gydF4y2Ba
弗兰克-蒙塔吉尼gydF4y2Ba	荧光- 1——特定的控制,离开了的一个荧光团完成面板占溢出gydF4y2Ba
向前散射gydF4y2Ba	FSC;散射来自细胞的前进方向反映了细胞的大小gydF4y2Ba
选通gydF4y2Ba	选择感兴趣的细胞群的过程基于细胞的特征gydF4y2Ba
柱状图gydF4y2Ba	图描绘了荧光或光线散射强度与轴上的细胞的数量gydF4y2Ba
同形像统计图控制gydF4y2Ba	抗体对抗原的细胞没有找到提高分析,用于评估非特异性结合gydF4y2Ba
激光gydF4y2Ba	发出特定波长的光gydF4y2Ba
PBMCsgydF4y2Ba	外周血单核细胞、外周血细胞包括淋巴细胞和单核细胞gydF4y2Ba
光电倍增管gydF4y2Ba	PMT,一个敏感的探测器的光在不同范围的电磁波谱gydF4y2Ba
边撒gydF4y2Ba	SSC;激光束的散射测量在90度反映了粒度或细胞的复杂性gydF4y2Ba
溢出gydF4y2Ba	荧光团的荧光信号测量通道的另一个荧光团,当两者都是测量在同一细胞上,导致假阳性信号gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

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