先进细胞筛查和成像揭示了药物开发的心脏系统响应

在药物发现中,时间和货币投资显著增加进一步的候选人通过临床前阶段的测试,分析和评估。排除不可行的原因安全性和毒性化合物,资源可以被重定向到最有前途的药物市场。

了解药物候选人的影响各种器官安全测试的一个核心元素,它也是一个行业的最大挑战。心脏和肝脏特别脆弱,这两个器官的毒性来负责在临床试验中30%的失败。¹

毒性,例如,是一个著名的许多药物的副作用和基于复合磨损的主要原因处于临床前阶段。¹评估毒性药物发现的前端允许研究人员识别潜在的有毒化合物和消除或修改他们提高安全性。因此,r美国不断努力寻找和开发测试准确地预测人类心脏细胞将如何应对潜在的药物——换句话说,创造更多的与生物相关化验。同样重要的是一个分析的适用性高通量筛选,以进一步降低高成本和低效率与化合物失败在诊所。¹

干细胞心肌细胞提供良好的模型系统

心脏是非常复杂,理解很重要,药物都对心脏细胞结构和功能的影响。然而如果没有先进的方法,很难有效和可靠地描述完整的阵列响应给定的化合物。

发展分析基于人类心肌细胞(心肌细胞),来源于干细胞来源,可以大大加快发展新的化学实体和提高药品安全,通过提供比目前更多的生物相关的细胞模型。依靠动物模型用于临床前毒性测试有重大缺陷。例如,老鼠可能不会像人类或代谢毒性敏感化合物不同。此外,这种方法通常是不可行的实验室要进行大量的试验药物的候选人。

越来越普遍的使用人类诱导多能干细胞(万能)。这些都是由人类血液细胞重编程为癌状态,此时他们可以进化成不同的组织包括肝脏、神经、心肌细胞。iPSC-derived人类心肌细胞离子通道尤其有吸引力,因为他们表达和演示自发机械以及类似于本机心肌细胞的电活动。结果,他们可以作为一个模型系统来衡量药物化合物的影响的自发收缩。

快速动力学荧光成像技术可以应用于测量的影响药理干细胞源性化合物在跳动的心肌细胞。分析采用 钙( Ca^{2 +} ) 敏感的染料来监控Ca的变化^{2 +}振动同步与细胞收缩,它允许监测振动速度,振幅和干扰的一种模式。

我们的工作都集中在心肌细胞来源于成人(细胞动力学,富士胶片)的细胞则有许多组件的“真实”或本机心脏细胞。²事实上,他们展示心脏细胞的自发机电活动,自然“承包”文化。

在我们先前的研究之一,³我们iPSC-derived心肌细胞暴露于不同浓度的超过100种化合物。其中包括化合物被认为是有毒动物心脏和其他证明人类有不利影响,以及控制,被证明是安全的。我们使用高通量细胞筛选方法 分析波动 Ca^{2 +}细胞内 ,因为 Ca^{2 +} 调节 心脏细胞活动和 同步与收缩 。要做到这一点, 我们应用Ca^{2 +}敏感的染料对我们的样品和记录信号模式使用fast-fluorescent动能读者仪器需要高帧频图像的Ca^{2 +}振荡 。

图1所示。答:延时心肌细胞富含钙的图像^{2 +}敏感的染料。Ca^{2 +}同步振荡发生机械运动的细胞单层。b细胞内钙的^{2 +}振荡记录使用FLIPR五高通量细胞筛选系统,而山峰被发现和分析2 ScreenWorks峰Pro软件。信号跟踪例子所示为控制模式,也为化合物以cardiotoxic效应:e - 4031,硝苯地平,dofetilide每个化合物(1微米)。出现二次峰值,峰值衰减延长,增加频率,或不规则观察治疗相应的化合物。

米测量振荡率和模式,如峰值振幅,峰宽,峰值、上升和衰减的振荡在暴露于各种化合物非常重要的信息化合物如何影响细胞。例如,去甲肾上腺素或咖啡因增加振荡的振幅和频率。止痛药减缓振荡。其他化合物可能有更复杂的振荡波形的影响或完全停止振荡。

复杂的分析提供了先进的软件允许检测和multiparametric Ca的表征^{2 +}振荡揭示复杂的模式,二级山峰,波形不规则,20多个其他重要的读数。这种模式的变化可以标记化合物潜在的有毒心脏功能。例如,钠(Na +)通道阻滞剂引起狭窄的山峰以及不规则跳动的模式。相反,药物阻止hERG通道与一个潜在的致命心脏病相关的人类被称为长QT综合症,出现生产高峰延长和二次单元中振荡试验。深入的分析、细胞和线粒体毒性以及心脏细胞骨架模式,可以使用高含量评价成像方法。获得信息在这个级别的细节让这对初步分析非常有用的毒性鉴定工作。

三维分析可能模仿生活的心更加密切

我们也开始将这些方法扩展到三维(3 d)心脏细胞模型,称为心脏球状体。⁴当心肌细胞放置在干细胞独特,U-bottom形状、低连接板,细胞自然形式几天之后球状体。类似于上述方法,我们可以使球状体暴露在各种化合物并测量他们的反应 Ca^{2 +}荧光和 高含量共焦三维成像 。3 d系统的一个优势是,除了测量 二维( 2 d)模型,它 允许其他参数如建筑或结构变化的分析。

图2。图像的心肌细胞生活在3 d(顶面板)或2 d文化(下半部分)。图片拍摄的ImageXpress®显微共焦系统染色后细胞钙黄绿素(可行性染料,绿色),线粒体完整性染料(MitoTracker橙色、红色),和核染料(赫斯特、蓝),10倍放大。细胞治疗相应的化合物(10 microm) 24小时。图像分析了使用高含量成像软件,允许计算数字和百分比的生存或死亡的细胞。值得注意的是,尽管大量的测试cardiotoxic化合物在Ca引起干扰^{2 +}振动试验,只有少数化合物细胞损伤引起的。

虽然比较结果来源于2 d和3 d模型,³我们发现两者之间的协议,但值得注意的差异反应浓度和时间依赖性的影响。研究结果表明,三维心脏球状体为一个拥有一些独特的模型优于2 d模型,可能更好的预测药物渗透到组织的一个方面。

细胞模型与更大的复杂性,如3 d,可以理解得到普及,因为他们的镜像在活的有机体内环境,可能更可靠的反应药物暴露。他们可能会透露更多有关细胞组织,信息和cell-matrix相互作用,药物渗透。

广谱的好处

还有其他有用的应用程序对这些方法不仅会发生心脏毒性接触药物,但也对环境化学物质 。 这些分子,副产品的汽油净化、农药、家用清洁剂和阻燃剂——被认为是负责心脏病病例的23%。⁵因此,在另一项研究中,我们使用的方法测试69环境化合物对心肌细胞的影响,发现该方法成功地识别通过测量变化的毒性影响 Ca^{2 +} 振荡模式。⁶最引人注意的就是相关的应用程序 Tox21 ,一项在多个政府组织,旨在制定环境化合物的毒性作用,因为仍有许多未知的结果对人类健康。⁷这种方法提供了一种方法来了解各种化学物质环境污染食品添加剂都可能影响身体的所有细胞和系统,允许快速和科学评价现有的物质造成的对人类健康的潜在危害及其化学替代品。⁸

引用

1。可乐我,兰迪斯j .制药行业可以减少人员流失率?自然评论药物发现。2004;3:711 - 715。doi:10.1038 / nrd1470

2。郭马J, L, Fiene SJ,等。高纯度人为多能干细胞心肌细胞:动作电位和离子电流的电生理属性。是杂志的心保监会杂志。2011年,301 (5):H2006-H2017。doi:10.1152 / ajpheart.00694.2011

3所示。Sirenko O,克伦威尔EF, Crittenden C,女士是的,赖特FA, Rusyn即评估击败人类诱导多能干细胞使定量参数在体外筛查毒性。Toxicol:杂志。2013,273 (3):500 - 507。doi:10.1016 / j.taap.2013.09.017

4所示。Sirenko O,汉考克可,Crittenden C, et al .表型特征的分析化合物影响诱导多功能干细胞心脏球状体。试验药物开发工艺。2017;15 (6):280 - 296。doi:10.1089 / adt.2017.792

5。Pruss-Ustun, Corvalan c .预防疾病通过健康环境:环境疾病负担的估计。世界卫生组织。2006:6 - 89。

6。毒性测试在21世纪:愿景和战略。国家研究委员会。2007年。

7所示。Sirenko O,格林FA, Ryan KR et al。在体外环境化学物质的毒性评估使用organotypic人类诱导多能干细胞模型。Toxicol:杂志。2017;322:60 - 74。doi:10.1016 / j.taap.2017.02.020

8。贾德森RS、Houck KA Kavlock RJ, et al。在体外环境化学物质的筛选目标测试优先级:ToxCast项目。环境卫生教谕。2010,118 (4):485 - 492。doi:10.1289 / ehp.0901392

写的

高级应用科学家,卡罗尔Crittenden分子设备

Oksana Sirenko高级研究科学家,分子设备