提出分析专家:对话与qPCR创新先锋教授Stephen参赛

MIQE指南2009年被释放,帮助协调qPCR实践,确保发布的可靠性数据[1]。中列出的点是那些有关精度、检测极限和qPCR仪器的线性动态范围。这些特性旨在确保仪器能够生成所需数据的准确性和可靠性得到有意义的结果。现代仪器,如生态48热循环(PCRmax),现在发展到使满足这些指导方针更简单,同时减少qPCR的时间和成本。

PCRmax:当代qPCR诊断面临的主要挑战是什么?

参赛教授:令人惊讶的是,也许最具挑战性的方面qPCR仍然是开发一个化验,生成好,有意义的结果。qPCR系统先进,用户的关系变得更加疏远原始数据,这使得它更容易忽略不可靠的结果。这就意味着研究人员通常没有意识到真正的他们的PCR反应的效率。没有强劲的验证是不可能知道化验检测,从而影响实验数据的可靠性。事实上一些最近的报告表明,多达90%的论文发表在《生物医学研究领域是unreproducible原因等。这是一个令人担忧的提醒qPCR过程完全理解的重要性,一个力推动MIQE发展的指导方针。

PCRmax:用户如何减轻这些风险和确保他们的结果可靠吗?

参赛教授:健全质量评估进展之前样品分析方法开发仍是最重要的方面。我们花了很多时间设计化验,并确保一切都是正确的在网上使用快速qPCR仪器来证实和优化这些数据。只有当我们充分完成这一步,我们继续实验的验证试验。自然,健壮的质量评估和验证是一个密集的过程所以雇佣qPCR仪器,提供快速放大MIQE框架内是至关重要的。

PCRmax:多大影响你认为有正确的工具吗?

参赛教授:显然是非常重要的,选择合适的技术。市场上有很多乐器qPCR和一些将会比其他的更有效的对某些应用程序。在过去的几年里我们的团队一直致力于建立一个分子诊断实验室基于扩展技术,如qPCR小说真菌和细菌诊断。所以对我们来说,任何发展中化验,乐器的本质属性你真正需要的是速度。

例如我们目前正在致力于一个项目评估inter-operatively在乳腺癌患者淋巴结。前哨淋巴结是从病人在剧院和送往实验室进行RNA提取。逆转录(RT) - qPCR反应然后执行筛选标记的转移的说明。我们使用的生态48热循环和大多数的试验开发工作因为它执行qPCR没有任何下降如此之快在准确性和重现性。在这种特殊情况下我们的优化减少了运行时间执行从提取整个化验分析29分钟。

PCRmax:你看到qPCR未来在哪里?

参赛教授:我编辑两个期刊和令人惊讶的是很多情况下我遇到传统终点PCR仍被用作化验它从来没有打算。终点PCR的第一个问题是,与qPCR不同,需要运行一个凝胶所以总有潜在的污染。第二,端点没有定量PCR。终点PCR有一些价值,在基因型和SNP分析应用,如对于很多其他应用程序,健全qPCR技术开发更合适。此外,qPCR仪器,如生态48可用于样品卷低至5µL,结合系统的效率等生态48岁,意味着qPCR运行的成本降低。在短期内,我希望看到qPCR完全取代终点技术,除了某些专家的应用程序。

未来,最大的一个是数字PCR技术的成熟发展。数字PCR已成为更容易部署和技术我们一定密切关注。然而明显有一些限制,尤其是所有仪器的高成本和复杂的过程。因为这个原因仪器像生态48仍有明显的优势;qPCR不仅快速、健壮的软件使处理反应非常简单。此外,大多数qPCR化验涉及看着一个消息在另一个的相对表达它只是没有必要数量的绝对精确的目标副本由数字PCR。我看不出数字PCR被出现场监控病原体,例如,已经有手持电池驱动qPCR设备可用来执行这样的实验。因为它的普遍性和巨大的适应性方面的仪器、试剂和应用可以肯定的说我们仍将使用qPCR在十年的时间。

背后的技术研究

敏感的检测到一个副本及热世界上最准确的块,Eco 48从PCRmax使研究人员能够超越所有必需MIQE指南和加速运行时,没有妥协的效率。

这是通过一系列的创新,包括小说块技术,提供完整的加热均匀性和快速周期在40分钟,敏感性提供±0.1 oc均匀性在整个块后立即每个温度变化(图1)。