CRISPR:提示和技巧有效交付到主细胞和细胞系

脂质转染、电穿孔、nucleofection病毒转导:有很多方法基因组编辑,在DNA, RNA和蛋白质的水平。然而,许多当前的技术耗时且效率低下,可以触发脱靶效应,或者是不适合细胞,尤其对转染。¹

一个新兴的方法用于研究、生物技术和医学是CRISPR / Cas9。相比技术,如锌指核酸酶(ZFNs)和转录activator-like效应核酸酶(取得),CRISPR承诺基因组编辑的通用和精确的机制。相关技术能够有效地使转染细胞类型和目标多个站点。这些品质,研究人员正在利用探索CRISPR的潜在应用,如生物研究、早期药物发现和开发新型细胞免疫疗法等疗法。

达到与CRISPR / Cas9 hard-to-transfect细胞

一些细胞——小学和多能干细胞,例如,比其他人更难使转染由于属性包括内吞作用的吸收机制,分裂率,代谢活动和免疫反应。转染细胞有效,基因组编辑过程必须考虑细胞类型等特征,选择,转染方法,和衬底的选择到他们的设计。

中发现的大肠杆菌1987年,CRISPR / Cas9通路的一部分天然基因组编辑过程中发现细菌的免疫系统,已经被用于在真核细胞基因组学。所谓的“指导”RNA (gRNA)结合互补的目标DNA,并形成一个复杂的Cas9核酸内切酶DNA直接削减在特定网站。不像ZFNs和取得,DNA结合域 CRISPR / Cas9 是RNA,而不是蛋白质。因此,域和核酸酶不融合,生产过程,促进了设计的新目标新指南rna更快、更容易,并允许特定的多路复用目标(如一个Cas9核酸酶可能与几个gRNAs)相结合。

直接目标与nucleofection细胞核

支撑的成功关键要素CRISPR / Cas9 gRNA的效率和Cas9交付到目标细胞。替代方法包括脂质转染,被动地介绍DNA通过合成脂质复合物进入细胞,病毒载体,只能艰苦的设计和支持基于DNA的基质。CRISPR / Cas9,然而,能直接调节组件 核 靶细胞的使用electroporation-based Nucleofection ™技术 。 这种技术利用的独特组合Nucleofector™设备,转染的解决方案和优化协议提供基质如DNA, RNA,核糖核蛋白(rnp)直接进入主细胞的细胞核和细胞线。这种技术导致转染效率高率与高转染后细胞的可行性。

的Nucleofector ™ 技术已被证明成功和有效地交付CRISPR基质直接通过预先优化电脉冲hard-to-transfect的细胞核。直接转移改善的机会实现高转染效率(包括非区分主要细胞),提示更快的基因表达,每转染需要较少的DNA,同时允许多个样品进行处理。

利用RNA核糖核蛋白以减少毒性

一些基因组编辑过程带来不必要的结果通过影响基因以外的目标,或引发毒性敏感细胞。一个相对较新的方法构建的风险使用rnp的基础上减少毒性在体外从Cas9蛋白质和gRNAs CRISPR衬底。rnp的使用提供了更大的控制基因编辑,有助于克服问题的信使rna基因组不稳定性提高了效率,允许修改转染后立即开始。反过来,这可能带来高基因敲除效率。²

毒性风险也可以降低交付Cas9封顶和poly-adenylated mRNA,半衰期较短的比质粒DNA。使用这种方法,Cas9信使RNA转染和翻译目标细胞的细胞质内,结合co-delivered“单一导RNA”(sgRNA)在进入细胞核。研究表明sgRNA可以化学改性进一步加强基因编辑效率和促进更大的基因中断hard-to-transfect如T细胞CD34 +造血干细胞和祖细胞。³

通过标签和co-editing丰富gene-edited细胞

确定需要几天gene-edited细胞通过磁场下拉试验或深度测序。新方法提供了快速、健壮的备选方案。在一项研究中,研究者证明非侵入性作为荧光标记物标记 丰富的细胞已经成功转染,增加一个基因编辑事件的可能性 。⁴他们荧光标记供体DNA Alexa 647,并受转染人类胚胎肾细胞和主成肌细胞fluorescence-activated细胞排序。

另一项研究使用了co-selection策略没有标记。⁵除了编辑目标基因,研究人员在ATP1A1编码为一个点突变轨迹。这种突变阻止gene-edited细胞受到ATP1A1抑制剂(乌本苷),但允许研究人员随后丰富修改细胞与乌本苷在感兴趣的另一个分离的轨迹。

一个多才多艺的和精确的基因组编辑方法

基因组编辑了重大的创新和进步CRISPR / Cas9的引入,但细胞转染阻力仍然是一个挑战。然而,通过快速交付组件直接针对细胞核,CRISPR技术带来的多功能性,精度和效率基因改造,同时尽量减少非目标效应和毒性,并允许快速、非侵入性细胞浓缩。使用CRISPR,研究者可以优化方法修改生理相关的细胞类型的基因,包括初级、茎和其他细胞或特别敏感 硬 来 使转染。

引用:

1。 古普塔智慧化,Musunuru k .扩大基因编辑工具:ZFNs,取得和CRISPR-Cas9。中国投资。2014年10月,124 (10):4154 - 61。doi: 10.1172 / JCI72992。

2。 塞其和Rutz。优化RNP转染高效CRISPR / Cas9-mediated基因敲除主要的T细胞。J Exp地中海,2018。

3所示。 Hendelet al。化学修改指导rna增强CRISPR-Cas基因组编辑在人类的主要细胞。生物科技Nat》, 2016年版。

4所示。 李et al。综合修改指导RNA和DNA供体CRISPR-Cas9工程是一个通用的平台。eLife 2017; 6: e25312 DOI:10.7554 / eLife.25312。

5。 Agudeloet al。不需要coselection CRISPR-driven基因组编辑在人类细胞。Nat方法,2017年。