液滴数字PCR提供NGS文库的精确定量
Fred Hutchinson癌症研究中心最近发表了一篇文章，展示了研究人员如何使用液滴数字PCR更准确地量化NGS文库——在降低成本的同时提高效率和吞吐量。
在这里，我们采访了Bio-Rad实验室的George Karlin-Neumann博士和Fred Hutchinson癌症研究中心的Jason Bielas，以了解如何充分利用这项技术来精确量化下一代测序库用于科学研究。
George Karlin-Neumann博士，数字生物学中心主任，Bio-Rad实验室(位于加州普莱森顿)
TN:您能介绍一下QX100滴滴数字PCR (ddPCR)系统吗?
Karlin-Neumann博士:Bio-Rad的QX100液滴数字PCRTM系统是一种简单的DNA分子计数技术，用于量化样本中的特定目标序列。它通过在液滴发生器中将每个PCR反应组合细分为数万个分区(均匀大小的液滴)来计数(或“数字化”)DNA分子的起始副本数量，在标准热循环器中将这些液滴热循环到96孔板的端点，并在液滴阅读器(2色液滴流式细胞仪)中通过其升高的荧光(即阳性液滴)来计数含有目标的液滴部分。在特定目标的低ddPCR浓度下，阳性液滴很少包含一个以上的目标分子，单位体积的阳性数量非常接近反应中分子的浓度;然而，在高ddPCR浓度下，液滴可能平均每液滴有5个目标拷贝，应用泊松统计量来正确确定反应的真实目标浓度是很重要的。然而，与模拟实时PCR测量相反，数字化测量不需要绝对定量的标准曲线。
TN:让研究人员能够准确检测线粒体DNA的ddPCR的关键特征是什么?
DKN:液滴数字PCR旨在精确、敏感和可重复量化DNA目标，而不考虑DNA的来源，无论是来自人类基因组或线粒体DNA，细菌基因组或质粒DNA，甚至是通过液滴中或液滴形成之前的逆转录从RNA中获得的cDNA。
一旦一种检测方法被验证，表明它对目标是特异性和定量的(在使用的运行条件下)，ddPCR就可以被正确地用于精确定量目标以及精确定量它。Bio-Rad的ddPCR技术使这些特性成为可能的关键特征在于其强大的化学，仪器仪表和信号分析。化学和微流体一起产生高度均匀和稳定的液滴，对移液，热循环和读取非常稳健。这些特性可以在大动态范围(~5对数)内实现高灵敏度(低至每个反应孔几个分子)和高精度，并加上端点热循环，这可以检测和精确定量不同大小的(删除目标)扩增子，正如Bielas实验室研究中所演示的那样。重要的是，这种组合系统的鲁棒性反映在每天和实验室之间的一致结果中，从而产生高可重复性和易用性。
TN:这是ddPCR的一个应用，还有什么其他的应用呢?
DKN:在许多已发表的研究中，QX100的常见用途之一是用于罕见序列和罕见突变检测或“大海捞针”问题，例如:在消灭艾滋病毒的努力中对潜在前病毒库的超敏感测量;评估转基因产品对食品的污染;液体活检研究(例如，通过血液中大量移植物DNA监测移植排斥反应，或通过无细胞DNA中的癌基因标记监测癌症患者对治疗的反应);人皮肤细胞中体细胞CNV镶嵌现象的检测。此外，研究人员正在寻找脑脊液生物标记物，以识别有阿尔茨海默病风险的症状前个体，并在患者血清中寻找miRNA癌症生物标记物。液滴数字PCR的另一个巨大好处是拷贝数变异(CNV)的测量，既可以揭示人类基因组的多等位基因CNV图景及其在遗传性疾病中的潜在参与，也可以为癌症患者的个性化治疗识别致癌CNV。它也通常用于进行绝对基因表达测量，而不需要标准曲线。其他已建立和正在开发的用途包括NGS文库的定量和质量控制，NGS结果的验证(例如CNV, RNA编辑或差异异等位基因表达)以及通过其在液滴中的物理连接进行标记的分期。
杰森·比拉斯，弗雷德·哈钦森癌症研究中心的代表
TN:您开发了一种新工具来精确量化和描述从头检测事件，即数字删除检测(3D)。你能多给我讲讲这个技巧吗?
Jason Bielas:众所周知，线粒体DNA (mtDNA)缺失会导致一些神经肌肉疾病、癌症和衰老。因此，研究它们的发生、克隆扩增到表型表达的机制具有重要意义。此外，这些变异可以作为疾病早期诊断的有价值的生物标志物。然而，目前还没有足够灵敏的方法来准确分析这些罕见的事件。
因此，我们建立了一种新的检测方法，称为数字缺失检测(3D)，它允许以前所未有的灵敏度测量DNA缺失突变。3D是一个三步过程，包括对缺失分子的富集，通过液滴数字PCR将基因组单分子分割成数千个液滴进行直接定量，以及使用大规模并行测序进行断点描述。
我们通过(1)询问超过80亿个线粒体基因组，(2)报告了有史以来第一个自发线粒体DNA缺失的无偏倚绝对测量，(3)确定了预先存在的缺失突变的扩展是人类大脑中与年龄相关的mtDNA缺失积累的主要因素，证明了3D无与伦比的吞吐量、灵敏度和技术进步。
与现有技术相比，3D技术有哪些优势?
JB:我们手稿中提出的工作代表了在检测、量化和描述任何性质的罕见等位基因变异或多态性方面的重大进步。虽然在我们的手稿中提出的初始效用和动机是检测mtDNA中的罕见缺失，但该分析绝不局限于此应用。鉴于我们的实验提供了这些突变的第一个真正的测量方法，它们的真正用途现在才开始确定。用于检测罕见缺失事件的相同原则也适用于罕见核变异的检测或疾病生物标志物的检测。敏感地检测此类事件的方法一直是广泛学科和应用领域的密集研究的主题。
TN:您的研究支持了这样一个假设，即预先存在的突变是导致与年龄相关的线粒体DNA检测积累的主要因素。这一发现的更广泛含义是什么?
JB:如果衰老和疾病是由线粒体DNA缺失的积累驱动的，那么专注于延长人类寿命的研究应该专注于防止这些事件的扩大。然而，这也意味着在早期生活中获得的缺失事件的水平可能会影响/设定一个人的寿命长度(无需干预)。因此，在生命早期预防突变事件的发生对于延长寿命也变得越来越重要。
TN:你如何看待3D检测对未来研究的帮助?
JB: 3D检测的主要好处是它提供了一种强大的手段来检测极其罕见的突变。线粒体对于正常的细胞功能至关重要，保持线粒体DNA (mtDNA)的完整性是确保线粒体功能的关键。然而，mtDNA维持的机制尚不清楚，也不知道与衰老和疾病相关的大量缺失是如何或何时获得的。Drs。肖恩·泰勒和我目前正在使用3D技术来帮助我们追踪这些突变的起源，并确定成人模式形成的关键时间段。然后我们也可以开始解决真正关键的问题，即这些缺失的扩大是否真的会导致衰老和疾病，以及这个过程是否可以控制。
188金宝搏备用科技网络编辑团队
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