酶法有望将DNA合成带回实验室

以下文章是丹·吉布森撰写的一篇观点文章。本文仅代表作者个人观点，并不代表科技网络的官方立场。188金宝搏备用

在DNA合成领域工作了近二十年后，我可以自信地说，各种技术和方法的共同缺陷是保真度、成本和有害废物的产生。

使用传统的化学方法，寡核苷酸(或称寡核苷酸，是制造更长的双链DNA(如基因)的基本构件)既可以由服务提供商生成，也可以在台式寡核苷酸合成器上生成。通过服务提供商，除了下订单，您不需要做任何工作。有高通量的选择，实验室不必处理处理危险废物。通过使用你自己的寡核苷酸合成器，你可以更快地得到你的寡核苷酸，你可以在任何时间构建它们，你可以控制寡核苷酸的质量和供应。不幸的是，你最终也会产生大量的危险废物，并有责任妥善处理这些废物。

但无论采取何种方法，制作oligo也存在保真性挑战。尽管化学合成方法很好，但耦合效率仍然不是100%。复合效应意味着，如果你正在构建一个100 mer的寡核苷酸，那么所需的全长产品的保真度将只有60%左右——这是一个无法接受的情况，因为即使是单个突变都可能导致实验失败。因此，误差消除方法如大肠杆菌采用克隆和测序，这增加了时间和成本。

这就涉及到成本问题。低聚物的化学合成非常昂贵。一个典型的寡核苷酸每个碱基的成本约为10美分。也就是说，构建一个基因需要300美元，构建一条遗传途径需要6000美元，构建一个小基因组需要20万美元。这是一个巨大的投资，只是一个设计，可能会或可能不会工作!

最后，还有浪费的部分。每合成96孔板的低聚物就会产生几升危险废物，这大约是构建一两个基因所需的低聚物的数量。这导致了一个两难境地:你可以使用服务提供商并让该公司处理危险废物，或者你可以通过建立自己的oligos来保持对质量和供应的控制，但你必须处理危险废物。

现在，新一代的合成技术正在出现，以克服这些挑战。基于酶促DNA合成技术(EDS)，他们承诺提供内部合成能力，这样科学家就可以在不产生有害废物副产品的情况下生产所需的DNA。通过实验室中基于eds的平台，研究人员将能够按需构建DNA，而不必等待供应商制造和运输它。

传统的DNA合成是基于磷酸酰胺化学，经过多年的优化，以相对较低的成本生产高质量的低聚物。但磷酸酰胺技术会产生危险废物，因此不适合在实验室使用。另一方面，EDS使用天然酶——或天然酶的工程版本——将单个核苷酸拼接到所需的序列中。在此过程中不需要有毒试剂，因此EDS避免产生有害的废物副产品。

有几种基于eds的方法正在出现。其中大多数依赖于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，这是一种在自然界中用于将核苷酸添加到DNA序列上的酶。

不幸的是，基于tdt的EDS技术还没有克服许多与成本和保真度相关的固有挑战。就成本而言，目前TdT酶的效率并不像它需要的那样高，需要更多的试剂来产生所需的序列。因此，与传统供应商的价格相比，基于tdt的方法每个基的成本要高出一个数量级。最重要的是，由于TdT酶的保真度，它也有较高的错误率。

我相信这些挑战可以通过利用一种类似组装的DNA合成方法来解决——这是一种混合方法，将最好的磷酸酰胺化学与已经被描述和使用了几十年的酶结合起来。这种混合EDS不是通过一次添加一个碱基来创建低聚物，而是使用酶将短低聚物构建块拼接在一起来创建目标序列。在这种方法中，磷酸酰胺化学被用来创建一个标准的、通用的积木库;然后，该文库被送到一台台式仪器上，该仪器执行短寡核苷酸连接和组装，以合成从寡核苷酸到整个基因或基因组的任何东西。

该方法具有较高的准确性和效率;由于合成一种结构所需的反应较少，出现错误的机会也就大大减少。它的成本也更低，因为库中未使用的构建块可以在数千甚至数百万个合成循环中反复包含。该技术还解决了浪费问题。危险废物被减少到最低程度，因为磷酸酰胺化学物质只被使用一次来创建一个库，并且它是在生产设施中产生的，在那里它可以得到适当的处理。内部台式仪器只产生无害的水废物，可以扔进垃圾桶或排入下水道。

无论是通过短寡核苷酸结扎，还是未来版本的tdt化学，EDS都有可能改变科学家在内部进行DNA合成的能力，并解决成本、保真度、周转时间和浪费等挥之不去的问题。从PCR引物和测序富集探针到mRNA疫苗模板，加速开发、降低成本和错误、消除实验室有害废物的能力将是对传统合成的重大改进。

作者简介:

丹·吉布森(Dan Gibson)是Codex DNA的首席技术官。行业标准吉布森组装的创造者^®他在合成生物学领域工作了近20年，曾在synthetic Genomics和J. Craig Venter Institute等机构工作。他拥有纽约州立大学布法罗分校的生物科学学士学位和南加州大学的分子生物学博士学位。