探索滴数字PCR技术

液滴数字PCR (ddPCR)技术是一种数字化的PCR方法,利用油水乳液体系。这种技术分区核酸样品到成千上万的nanoliter-sized滴。然后,在每个液滴进行PCR扩增。这种方法需要较少的样本比其他PCR方法可用,这是有利的在许多设置。最近,我们采访了乔治•Karlin-Neumann数字生物集团主管临床Bio-Rad实验室了解ddPCR及其应用。

莫莉·坎贝尔(MC)滴是什么数字PCR和其主要临床应用是什么?

乔治Karlin-Neumann (GKN):数字PCR (dPCR)是一种方法来检测和量化目标核酸序列样本细分为许多小的分区,或隔间,每个包含或不包含感兴趣的目标。积极的分区(即强烈荧光)被计算在运行一个典型的Taqman反应端点。

液滴数字PCR (ddPCR)是一个实现dPCR,利用动态生成液滴的分区,而不是成品nanochambers示例。ddPCR,水滴读列纵队滴流式细胞分析仪进积极的和消极的水滴的数量在一个样本,这使得科学家们确定目标分子存在于样品的浓度。ddPCR是一种技术,可以检测和精确量化各种类型的DNA和RNA变化与高度的可靠性和使用一个非常小的或大量的样本(即只有少数或> 100000份所需的目标存在)。这种能力使它有用的应用程序,如液体活检使用血液样本,并迅速被实验室采用。ddPCR通常受雇于癌症研究人员和肿瘤学家跟踪疾病进展并确定治疗的反应。这样一个测试非小细胞肺癌患者使用血液样本检测DNA突变和肿瘤学家在72小时内返回结果,成像结果可能是前几周或几个月。

临床试验基于ddPCR技术,QXDx CR-ABL %工具包,FDA已经CE-IVD-marked和清除。医生可以使用这些系统和测试,以检测微小残留病慢性粒细胞白血病患者的治疗决策有更大的确定性。Bio-Rad的QX200 ddPCR系统还显示承诺在其他应用程序中,临床和非临床。临床应用包括监测的有效性肾、肝和肺移植和检测胎儿非整倍性和孟德尔疾病的非侵入性的产前测试,病原体,和新生儿遗传性疾病如脊髓性肌肉萎缩症。在研究实验室,ddPCR可以使用检测和测量单核苷酸变异,indels,拷贝数变异,基因重组、基因结构、DNA甲基化,和基因转录和microrna水平,尤其是应用于癌症液体活检,传染病研究和临床测试。最后,ddPCR还可以用于环境测试,如测量水质和通过基因改造食品污染。

主持人:为什么它有利于使用ddPCR液体活检和门店在一起,而不是分开吗?

GKN:ddPCR和门店服务两个关键,但独特的角色在液体biopsy-based癌症诊断。液体活检,医生可以收集肿瘤游离DNA从血液或其他体液如尿液和检测和量化已知突变开出靶向治疗或跟踪病人的反应和疾病进展基于肿瘤的基因档案。上天是黄金标准技术识别小说在ctDNA突变和重组,最终影响癌症恶化。通过基因面板或全基因组测序,总会产生一个广泛库存突变的肿瘤。但成本高昂使用门店跟踪这些突变。也是劳动密集型和周转时间要长得多,返回结果ddPCR相比,通常具有更大的精度,敏感性和特异性改变。结合ddPCR和门店,然而,可以利用的好处和克服这两种技术的局限性。一旦上天用来检测突变的全套ctDNA,研究人员可以依靠ddPCR监测的灵敏度和精度较小的可行的基因标记和追踪肿瘤进展和治疗反应在近乎实时的。液滴数字PCR的优势在挥动速度和可购性使它更具吸引力的连续监测。ddPCR还使报告绝对份突变每毫升血液中,这可能是一个更健壮的度量比突变等位基因频率(加)当需要精确的定量测量做出临床决策。

主持人:为什么ddPCR比上天更划算?

GKN:与门店,它提供了一种自上而下的基因组,ddPCR侧重于精确和可再生的检测和量化的目标与表型的意义。ddPCR还需要最少的样本在运行测试之前的操作;它不需要图书馆建设,如上天。此外,ddPCR是健壮的,可再生的,和宽容的抑制性物质,使失败的反应少见。良好的动态范围和灵敏度,以及多路复用超过2目标量化ddPCR反应将使只有一个或几个井运行对大多数生物测量。

主持人:ddPCR如何被用来预测癌症复发后手术?

GKN:使用ddPCR技术评价液体活检样本使医生能够预测早期治疗期间病人会如何回应。我们看到在众多癌症患者循环肿瘤DNA (ctDNA)水平与他们的治疗结果。例如,今年在美国癌症研究协会会议上,研究人员理论水平的研究表明,ddPCR可以预测患者是否恶性胸膜间皮瘤(传销)积极回应手术。相比,科学家之间的遗传差异肿瘤和正常组织在11个患者MPM和发达ddPCR试验,检测MPM-specific ctDNA。当他们测试病人手术前采集血液样本,他们发现患者MPM-specific ctDNA手术后的预后更差。在另一项研究发表于美国临床肿瘤学会会议上,今年研究人员使用ddPCR追踪基因重组和拷贝数变化ctDNA儿科患者的骨肉瘤。在跟踪这些病人手术或化疗前后,他们发现重排标记的存在预测治疗效果在85%的病人和与复发的可能性。

司仪:存在任何限制使用ddPCR在临床环境?

GKN:ddPCR-based液体活检并不是为每一个癌症患者有效。ddPCR只能检查少数基因突变和少量的目标。在癌症,需要大量的候选基因突变的分析,门店将会是一个更好的方法。最后,由于液体活检一般依靠ctDNA,无论是ddPCR或门店适合监测肿瘤DNA不释放进入血液,如脑瘤。对于癌症这样的传统技术,如成像可能更有效。

司仪:ddPCR技术如何继续提高前进吗?

GKN:ddPCR技术已经可以用来可靠地监测患者对治疗的反应很短的周转时间。Bio-Rad正在增加的能力ddPCR更高级别的复用,有限的样本是可用的和最大灵敏度是多个目标的期望。实现更强大的扫描方法ddPCR可以允许我们屏幕的DNA片段在多个位置改变基因组的特定区域。

未来,Bio-Rad正在增加的能力ddPCR更高级别的复用,有限的样本是可用的和最大灵敏度是多个目标的期望。我们也在开发方法与NGS-profiled样本ddPCR更好的界面,提高医生的能力监测患者对治疗的反应和疾病进展。

除此之外,重要的是学习更多关于我们自己的生物学。ddPCR表明承诺不仅在癌症,但也包括艾滋病毒在内的其他条件,器官移植,I型糖尿病。当我们了解更多关于遗传学和表观遗传学在疾病中的作用,研究人员将开发新的ddPCR-based化验条件,使更多地使用ddPCR技术在实验室和诊所。

临床主任乔治•Karlin-Neumann数字生物集团Bio-Rad实验室,与莫莉坎贝尔说,科普作家、技术网络。188金宝搏备用