抗体是一种最重要的生物医学科学研究工具。近年来,许多研究已经公布的数据的可靠性提出质疑,并强调了劣质抗体是如何导致缺乏一致的结果(波尔多等。2010年,普林茨et al . 2011年,贝克和Dolgin 2017)。

抗体是什么验证吗?

“抗体验证实验证明和文档,一个特定的抗体适用于一个应用程序或目的”(韦勒2018)。为了解决这个问题,国际工作组抗体验证(IWGAV)提出广泛的抗体验证指南(Uhlen et al . 2016年)。IWGAV定义五个验证支柱进行验证测试提供了一个框架。正交策略,其中包括遗传策略,独立抗体策略,标记蛋白质的表达,immunocapture质谱(MS)紧随其后。

PrecisionAb抗体,抗体增强验证Bio-Rad PrecisionAb抗体的范围

在Bio-Rad,我们致力于为我们的客户提供可靠的研究工具和不断提高我们的抗体质量标准。PrecisionAb抗体范围,严格在免疫印迹检测的特异性和再现性,旨在帮助研究人员产生高质量的免疫印迹数据。我们还扩大应用PrecisionAb抗体测试包括免疫荧光(如果)和免疫沉淀反应(IP)(图1)。

PrecisionAb抗体是评估在多个生物相关的细胞溶解产物和组织表达内源性目标(图1)。相关,消极的控制和其他重要的样品,如人类血清和人类或啮齿动物组织溶解产物,是包括在内。对于每个抗体,我们仔细回顾文献确定溶解产物表达目标和预期使用这个评估抗体。西方的屁股由科学家们仔细观察数据比较相关的生物信息学数据库引用对signal-to-background比例,确保只有最好的抗体被选为PrecisionAb抗体。

图1所示。,整个细胞溶解产物的免疫印迹分析;探讨了细胞核抗原抗体(VMA00018)其次是检测合共轭山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(1/10,000 STAR207P)和可视化ChemiDoc议员5秒的曝光。增殖细胞核抗原(分子量29 kDa箭头指向)。B,海拉细胞沾5µg /毫升鼠标Anti-GPI抗体(VMA00348、绿色)。赫斯特被用作核染色(蓝色)和20 x目标成像。


图1所示。一个,免疫印迹分析多个细胞系增殖细胞核抗原抗体;探讨了(VMA00018增殖细胞核抗原(分子量29 kDa)箭头指向)。B,海拉细胞沾5µg /毫升鼠标Anti-GPI抗体(VMA00348、绿色)。赫斯特被用作核染色(蓝色)和20 x目标成像。

使用Bio-Rad没有污点成像技术,我们监测蛋白质加载一致性和传输效率。

透明的验证方法

我们理解透明度的重要性在我们的生产和测试过程中,指导客户正确的试剂的研究需求。出于这个原因,每个抗体有深入的信息包括其使用的免疫原代的细节,和推荐条件建议应用免疫印迹。西方的屁股不裁剪狭窄的分子量范围,所以任何额外的乐队和脱靶效应从来没有被排除在外。回顾抗体的抗体和出版物的信息已经使用也提供。

基因敲除和可拆卸的验证

在Bio-Rad,我们正在采取必要的措施使研究人员能够执行可靠的和可再生的使用我们的抗体免疫印迹实验。

遵守IWGAV建议,我们也实现five-pillar推荐的验证方法验证的方法。这包括基因敲除使用CRISPR / CAS9后跟比较淘汰赛的靶蛋白水平与野生型细胞(图2)。

图2所示。波形蛋白免疫印迹分析CRISPR淘汰赛海拉(波形蛋白KO)和野生型海拉(WT)完整的细胞溶解产物与一个探索,人类Anti-Vimentin抗体(VMA00008)和B, hFAB罗丹明Anti-Tubulin主要抗体(12004166)。C,归一化波形蛋白的信号强度CRISPR淘汰赛和野生型溶菌产物。信号强度归一化总蛋白。

图2所示。波形蛋白免疫印迹分析CRISPR淘汰赛海拉(波形蛋白KO)和野生型海拉(WT)完整的细胞溶解产物与一个探索,人类Anti-Vimentin抗体(VMA00008)和B, hFAB罗丹明Anti-Tubulin主要抗体(12004166)。C,归一化波形蛋白的信号强度CRISPR淘汰赛和野生型溶菌产物。信号强度归一化总蛋白。

我们还执行siRNA击倒。图3说明了siRNA-treated之间的差别(图3巷1和2)和未经处理的(图3巷-)细胞免疫印迹特定CCAR2抗体(VMA00564)。我们量化信号强度为每个小干扰rna介导抗体通过验证方法(图3 b)。小干扰rna治疗抗体反应信号样本相比,强度降低和控制样本证明抗体的特异性。提供的数据表和验证数据在线为每个抗体是batch-specific。

图3所示。,免疫印迹分析整个从HEK293细胞溶解产物准备分别转染有两个独特的核工器对CCAR2(1 & 2),或者一个小干扰rna(-)炒;探讨了鼠标Anti-CCAR2抗体(VMA00564)和hFAB罗丹明Anti-Tubulin主要抗体(12004166)。

图3。一个,免疫印迹分析整个从HEK293细胞溶解产物准备分别转染有两个独特的核工器对CCAR2(1 & 2),或者一个小干扰rna(-)炒;探讨了鼠标Anti-CCAR2抗体(VMA00564)和hFAB罗丹明Anti-Tubulin主要抗体(12004166)。可视化ChemiDoc议员成像系统的一个60秒(化学发光通道)和10秒(罗丹明通道)。B、规范化的信号强度CCAR2微管蛋白的信号。

IP-MS验证

为抗体目标验证,我们也实现免疫沉淀反应质谱(IP-MS)紧随其后。首先,我们优化选择抗体的免疫沉淀反应。接下来,IP女士洗出液样本分析的识别蛋白质的肽序列样本。为了验证目标特异性,减去背景之后,我们看看独特的肽检测和蛋白质丰富的数量(总丰度从给定的蛋白质肽)。重要的蛋白质被大量独特的肽和丰富。这种验证方法表明抗体可以识别在内源性表达的同源抗原水平细胞溶解产物。

图4所示。免疫沉淀反应的POLR2A K562细胞溶解产物。


图4所示。免疫沉淀反应的POLR2A K562细胞溶解产物。输入通道输入的10%。POLR2A-IP车道POLR2A抗体的免疫沉淀反应(VMA00613)。IgG-IP巷是与鼠标单克隆免疫球蛋白(免疫沉淀反应MCA929)。免疫印迹分析使用POLR2A抗体(VMA00613),其次是检测合共轭山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(1705047)和可视化ChemiDoc像素的成像系统。箭头指向POLR2A。

Phosphorylation-Specific抗体验证

phosphorylation-specific抗体,我们验证通过比较抗体绑定在治疗(激酶激活或抑制磷酸酶)与未经处理的细胞溶解产物,并脱去磷酸蛋白免疫印迹膜。展示不同的绑定phospho-specific特点和总蛋白的抗体,phospho-specific PrecisionAb对总PrecisionAb抗体抗体进行比较。这使研究人员能够评估不同治疗的影响,提供了一个控制推荐(图5)。

图5所示。免疫印迹分析HepG2未经处理和EGF治疗整个细胞溶解产物;探讨了,老鼠Anti-STAT3抗体(VMA00242)或B,鼠标Anti-STAT3 (pSer727)抗体(VMA00755),其次是检测与合共轭山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(1/10,000 STAR207P)。

微型计算机体积很小。免疫印迹分析HepG2未经处理和EGF治疗整个细胞溶解产物;探讨了,鼠标Anti-STAT3抗体(VMA00242)或B,鼠标Anti-STAT3 (pSer727)抗体(VMA00755),其次是检测与合共轭山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(1/10,000 STAR207P)。膜处理(+)和(-)λ蛋白质磷酸酶和可视化ChemiDoc议员成像系统一个52秒或B,300秒的曝光。STAT3 (pSer727)的分子量为84 kDa。

选择合适的抗体

需要一点清晰和指导时抗体的选择吗?

我们的对你的实验选择合适的抗体引导你完成的关键因素在选择抗体。不要忘记Bio-Rad还提供了无与伦比的技术支持对于那些查询,需要专家的帮助。我们致力于为你提供产品和指导来帮助你和你的实验成功。

选择验证抗体可信赖的数据

选择验证抗体可信赖的数据由Bio-Rad了解实现的验证方法,包括CRISPR-Cas9基因编辑、核,和免疫沉淀反应其次是质谱分析,确保我们的抗体的特异性和可靠性在您的应用程序。

引用

  • 贝克M和Dolgin E (2017)。癌症再现性项目发布第一个结果。自然541 (7637),269 - 270。
  • 波尔多J et al。(2010)。抗体验证。生物学技术48 (3),197 - 209。
  • 普林茨F et al。(2011)。信不信:我们可以依靠发表数据潜在的药物靶点?Nat牧师药物越是加大10(9),712年。
  • Uhlen M et al。(2016)。提议的验证抗体。自然方法13日,823 - 827。
  • 韦勒毫克(2018)。十个抗体验证的基本规则。肛门化学的见解13:1177390118757462。
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