由Morphologically-Directed拉曼光谱表征蛋白质聚合gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

光学显微镜一直用来描述颗粒在biotherapeutic配方,提供它们的大小,形状,和透明的特点,可用于组颗粒成不同的类(即骨料、硅油、杂物污染物)。然而,显微镜的能力提供明确的识别它收集仅限于二维图像。的拉曼光谱自动显微镜系统提供一个健壮的主要识别方法的验证粒子化学,和在一起的技术提供了潜在的枚举,描述,并识别微粒在本地配方,以及那些固定在衬底的过滤器。这个范围的功能直接地址FDA药品质量要求由注入,单位体积颗粒计数。本条例实施通过USP < 788 > 1,需要枚举的微粒在两个大小类别:大于10μm大于25μm。最近发布的USP 2 < 787 >和< 1787 >扩展的建议包括大小低于10μm。这较低的尺寸范围吸引了大量的注意力从FDA因担心有关蛋白质aggregates3免疫原性反应,降低了产品的功效,和一般的安全。配方的稳定性会受到许多因素的影响,导致聚合material4的形成,5。gydF4y2Ba

的Morphologi®ID;从莫尔文Panalytical混合光学microscope-Raman光谱仪,提供高分辨率的光学显微镜的成像能力的化学识别能力台式拉曼光谱仪,可以完全自动化。本应用笔记探索Morphologically-Directed Morphologi ID的使用拉曼光谱(mdr®)来识别和分析污染物包括蛋白质聚集在强调样品的溶菌酶,和比较粒子悬浮在一个薄路径湿电池与收集过滤膜。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

Morphologi ID从莫尔文Panalytical被用于定位颗粒形态特征(尺寸、形状、和透明度),并使用拉曼光谱识别物种化学。Morphologi ID的放大10倍,提供一个有效的降低2μm粒子数的大小限制。这个放大的实际大小上限是200μm,尽管这可以显著延长包括粒子缝合,这是能够“重组”的图像颗粒跨越一个或更多的视野。拉曼光谱收集使用3μm现货785海里的50 x放大激励(~ 20 mW)从150厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba到1850厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在6厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba决议。gydF4y2Ba

两个独立的100毫克/毫升,pH值7.1解决方案的溶菌酶是强调生产总量:一个是用于基于过滤器的分析,另一个用于suspension-phase分析。gydF4y2Ba

膜过滤gydF4y2Ba

溶菌酶制剂之一是16个小时在室温下快速搅拌。整除(1毫升)聚合悬浮,掺入了少量的聚苯乙烯乳胶球作为参考物种,是纤维素纤维微孔进行真空过滤使用47毫米GSWP过滤器。过滤器贴在载玻片和被允许干之前检查。循环扫描面积15毫米半径在10倍放大扫描为了描述微粒并记录它们的位置。微粒被分成组根据它们的大小和形态,和每组的子集被选为拉曼光谱分析。gydF4y2Ba

暂停样本gydF4y2Ba

第二个溶菌酶制剂是在45了gydF4y2Ba^ogydF4y2Ba然后分析了suspension-phase C为4个小时。悬挂的整除(55μL)交付给一个专有thin-path湿电池(25μm路径长度)与石英窗口。细胞被允许达到热平衡考试前15分钟。20毫米半径扫描区域研究,对应31.4μL体积。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

群体大小为粒子计数包括定义2μm 10μm(小),10μm 25μm(媒介),大于25μm(大),外加一个特定群体40μm聚苯乙烯乳胶球。从每组选择的图像检测到的粒子膜过滤器示例如图1所示。gydF4y2Ba

图1:从每个大小乐队代表粒子图像定义为溶菌酶膜滤器样品。注意,每组的规模是不一样的。gydF4y2Ba

聚苯乙烯粒子是明亮的白色的颜色由于高度真空(episcopic)照明几何用于收集数据。粒子的聚合组出现深色,有各种各样的形状特征。最后统计数据如图2所示。gydF4y2Ba

图2:粒子计数为混合收集样品的溶菌酶聚合和40µm聚苯乙烯乳胶膜滤器。注意对数轴gydF4y2Ba

结果显示在图2显示增加粒子数粒径减少,这类似数量的大聚集类型粒子和聚苯乙烯粒子被发现在实验。总粒子数远高于预期的商业样品没有被强调,但解释的计算和描述能力Morphologi ID。gydF4y2Ba

拉曼光谱收集30粒子集团聚苯乙烯的标签。其中,29日被确定为聚苯乙烯乳胶,给一个蛋白质的光谱。考试后,似乎有溶菌酶聚合在靠近聚苯乙烯粒子的光谱记录。此外,14个光谱采集的大(> 25嗯)组。所有光谱收集可用的低功率为30秒积分时间设置(~ 5 mW)。14个额外的光谱收集,13被确定为溶菌酶聚合,引发了一个广泛的荧光光谱和被橡胶(插图、绿谱)。例子背景的光谱过滤器,一个蛋白质的粒子,一个橡胶球和一个橡胶粒子是如图3所示。示例说明收集到的光谱的能力Morphologi ID来识别subvisible微粒膜过滤,即使他们是弱散射材料,如蛋白质聚合。gydF4y2Ba

图3:代表光谱从过滤收集的溶菌酶样品:膜过滤背景(黑),溶菌酶聚合(蓝色),聚苯乙烯球(红色)。插图(绿色)显示了一个橡胶粒子的光谱样本中发现的gydF4y2Ba

选择的粒子图像从每组检查thin-path湿电池如图4所示。这些粒子图像的观察显示出截然不同的颗粒形态比记录的样本捕获膜过滤器。过滤总量似乎是水晶,而观察悬浮样品出现更加分散。事实上,它可能会辩称,溶菌酶的微粒悬浮似乎一系列规模较小的骨料收集在一个更大的身体(图5)。这一结果表明,改变压力条件(样品制备和/或集合)可能已经改变了溶菌酶的聚合机制。gydF4y2Ba

图4:代表粒子图像的每个大小乐队为溶菌酶定义示例悬浮。注意,每组的规模是不一样的。gydF4y2Ba

图5:图像记录的最大的聚合粒子从样本(左)和过滤从暂停样本(右)gydF4y2Ba

形态学结果暂停样品在相同的方式分组根据大小过滤样品:大小箱覆盖-10μmμm(小),10μm - 25μm(媒介),和25μm +(大),结果总结在图6。gydF4y2Ba

图6:粒子数为悬浮溶菌酶样品收集。注意对数轴gydF4y2Ba

粒子悬浮样品的数量大大高于对过滤后的样品,除了最大的总量。这个结果,连同两个样本类型的形态学观察,并表明,样本之间的聚合机制不同。gydF4y2Ba

粒子光谱收集了一系列小的大聚集积分时间在2分钟。25个粒子进行检测时,发现有三个标识为纤维素和其他22日确定为蛋白质的。例光谱如图7所示。gydF4y2Ba

图7:代表从悬浮溶菌酶样品收集的光谱:纤维素粒子(黑),溶菌酶聚合(蓝色和红色)。地区与常见的拉曼特征蛋白质的材料是用绿色突出显示gydF4y2Ba

虽然光谱噪声,识别的物种是完成使用近似乐队的位置。例如,红色和蓝色光谱被检查确认为蛋白质的760厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba色氨酸乐队,1000厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba苯丙氨酸乐队,1250厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba酰胺三世乐队,1400厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba不对称CHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba弹力带,1650厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba我带酰胺。频谱的黑色,纤维素的粒子,显示了特色~ 1100厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba紧身上衣,~ 1400厘米gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba三联体的纤维素。因此,即使对于显微镜50μm粒子悬浮,Morphologi ID可以提供光谱用于颗粒的识别。gydF4y2Ba

应该注意的是,尚未有结论关于详细的结构信息对蛋白质的粒子在过滤器或暂停,gydF4y2BaegydF4y2Ba。gydF4y2BaggydF4y2Ba。gydF4y2BaαgydF4y2Ba螺旋,gydF4y2BaβgydF4y2Ba表,或无规卷曲构象。数据收集时间可以增加提高光谱的信噪比,可以提供更多的细节。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

微粒枚举和特征是特别感兴趣的领域的biotherapeutic配方。USP < 788 >要求评估的粒子在10μm 25μm 25μm和更大的规模和范围。然而,有新的行业兴趣访问sub-10μm规模范围内,为新的FDA建议符合预期。光学显微镜,如Morphologi ID,适合操作在这个尺寸范围,并提供承诺提供高分辨率图像和样本粒子计数100%体积。gydF4y2Ba

拉曼光谱扩展这些功能,允许化学粒子的识别。这直接地址USP中概述的要求< 787 >枚举和形态特征,增加强度的直接明确的化学识别subvisible(2μm -100μm)粒子。拉曼光谱是众所周知的技术与化学特异性高,并能区分相似的化学材料由于独特的振动结构的离散的化学实体。未知的材料通常是通过审讯确定图书馆的参考资料,可以更新,包括特定于用户的化合物。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

自动化的结合使用显微镜和拉曼光谱成功地检测和识别微粒物种从溶菌酶样品悬挂在一个举行thin-path湿电池后,也通过膜过滤。这种技术组合提供给用户的灵活性来测量样品在他们的原生状态,或孤立颗粒基质适合进一步分析方法。粒子形态可以用来区分外部污染物总量,以及不同类型的聚合物。此外,这种技术提供了承诺研究结构性差异总物种通过拉曼光谱的变化。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

1。美国药典,< 788 >:在注入颗粒物gydF4y2Ba

2。美国药典,< 787 >:Subvisible颗粒物在注射治疗性蛋白质gydF4y2Ba

3所示。A.S.罗森博格,蛋白质总量的影响:免疫学的角度。aap日报8日E501-E507 (2006)gydF4y2Ba

4所示。H.C.马勒,w .薯条,Grauschopf, s . Kiese蛋白质聚合:通路,诱导因素和分析。制药科学期刊》98期(9),2909 - 2934 (2009)gydF4y2Ba

5。阿明,逝者Barnett J.A.帕沙克,C.J.罗伯茨和另外Sarangapani蛋白质聚合粒子形成、特征和流变学。目前看来在胶体与界面科学(2014)gydF4y2Ba