表征蛋白质交互使用三重检测尺寸排阻色谱法(SEC-TD)

介绍

蛋白质的能力形成有序,结构配合物是其生物功能的核心。这种复合物,可homo-oligomers或hetero-oligomers,可以控制不同的属性,如活动,稳定和本地化。了解这些复合物形成,背后和控制机制,是我们的知识基础的蛋白质信号通路和他们控制的生理反应。特别感兴趣的领域,是毒性因子复合物的组装从致病微生物。这些因素都是由这些微生物分泌的促进感染,生存和/或殖民的主机,因此疾病发病的关键。能力目标和抑制这些毒性因素可能导致新一代的抗菌疗法的发展。先决条件是了解异性的机制形成和homo-oligomers。为了描述选择微生物毒力因子的蛋白质相互作用,先进的光散射检测器,结合液相色谱方法了。

材料和方法

准备材料和蛋白质所描述(见参考文献1、2、3、4)。

特性粘度和分子质量的测量是由SEC-TD,尺寸排阻色谱(SEC)系统连接到一个三重探测器阵列,TDA(英国莫尔文)。TDA包含(我)一个静态光散射单元有两个光电二极管探测器,在7°低角度(lal)和在90°角激光光散射(、),(2)微分示差折光检测器,(3)光度计,(iv)一个微分粘度计。蛋白质浓度测定用光度计和示差折光检测器。、和拉尔数据,结合浓度,提供了分子质量m .固有粘度(η)是计算使用微分粘度计。分子质量和特性粘度与OmniSEC计算软件。

结果

蛋白质的构象,形成复合物的细菌毒力因素进行了研究。尺寸排阻色谱法,利用耦合三探测器阵列,对于这些蛋白质的行为产生了关键信息,如下所述。

形成homo-oligomers

homo-oligomers的形成可以由许多因素控制。这里,钙的影响绑定,或者调节肽的存在,进行了研究。毒素的“重复”(RTX)主题是出现在许多毒性因素致病微生物分泌的。的calcium-dependent腺苷酸环化酶毒素从百日咳博德特氏菌(CyaA)利用RTX重复域(RD)引起钙的回应。两个RD子域,RC_年代和钢筋混凝土_l(2)Ca的响应特征^{2 +}绑定(图1)。

图1所示。水动力性能的钢筋混凝土_年代和钢筋混凝土_l由SEC-TDA多肽分析。钢筋混凝土_年代(A)和RC_l(C)多肽,在没有(虚线)或在5毫米CaCl(实线)₂。对应于直角痕迹光散射(绿色痕迹),微分折射计(黑色痕迹),和微分粘度计(红色痕迹)。分子质量(绿线)和固有粘度(红线)给出RC_年代(B)和RC_l(D)没有(虚线)或存在钙(实线)。

基于直角散射数据(绿色痕迹)和微分折射计(黑色痕迹),它可以推导出钢筋混凝土_l构建具有相同的分子量Apo (- Ca^{2 +})和整体(+ Ca^{2 +})形式(图1)。然而,保留量的差异,18毫升22毫升Apo和整体形式,分别证明肽有较小的流体力学体积时绑定到钙。此外,绑定的钙引起的固有粘度下降13.7到3.9 mL.g¹。与钢筋混凝土_l钢筋混凝土构造,绑定的钙_年代保留体积没有变化,但导致分子量的增加,从15.1 kDa 42 kDa,和减少固有粘度从14.7到6.4 mL.g吗¹。综上所述,这些数据表明,绑定后钙、RC_l采用一个更小的,紧密形成单体的构象,而钢筋混凝土_年代形成一个紧密结构相同大小的三聚物作为展开单体中观察到缺乏钙。

图2。公认的前肽的去除效果ClpP2大会。ClpP2(上半部分)和ClpP2R13变体(下图)分析与三重检测尺寸排阻色谱法。折射率(黑线)和分子质量(红线)策划作为洗脱体积的函数。静态光散射获得的平均分子量表示每个峰的顶端。

ClpP2 ATP-dependent蛋白水解的复杂,被认为有助于的能力结核分枝杆菌潜伏在宿主细胞时间很多年了。在活的有机体内ClpP2 tetradecameric复杂形式,需要完整的肽酶活动,虽然这个复杂的形成和控制机制是什么,仍不清楚。无序氨基肽序列已经提议在监管中发挥作用。因此,野生型ClpP2和一个氨基端截短形式,分析了ClpP2R13,用尺寸排阻色谱法检测的三倍。这些数据如图2所示。ClpP2筛选了作为一个主峰,分子量140 kDa。这对应于六聚体的组合和七聚物。然而,删除氨基prosequence导致三大主峰482 kDa, 148 kDa, 46 kDa。对应于一个分子量最大的物种21-mer homo-oligomer。虽然这是大于tetradecamer预期,这些数据点的prosequence ClpP2作为监管机构在高阶低聚物的形成。

形成hetero-oligomers

许多蛋白质的活动由绑定不同的监管机构控制蛋白质,活化剂或抑制剂。这里,复杂的细菌毒性因子与特定的调节蛋白研究借助SEC-TD。CyaA百日咳博德特氏菌的主要毒力因子,百日咳的病原体。后绑定和激活的钙调蛋白(CaM), CyaA诱发致病性的生产水平的阵营。

图3。尺寸排阻色谱法,其次是三探测器阵列的AC(…),凸轮(- - -),和AC-CaM复杂(-):(a)紫外线吸收色谱,(B)直角光散射色谱、色谱(C)压差,(D)分子质量(y轴,粗线)和固有粘度(y轴,细线)为每一个物种。

SEC-TD单个组件的数据,和hetero-complex如图3所示。的分子量CaM-CyaA催化域(AC)复杂的决心58.4 kDa,约等于总和的单体的分子量(43.8 kDa和17.2 kDa AC和凸轮,分别)。这些数据强烈建议由复杂的凸轮和1:1化学计量学交流,支持结论,分析超速离心法(AUC)数据(没有显示)。从SEC-TD固有粘度数据分析产生的值5.2,4.9和5.0 mL.g¹分别交流、凸轮和CaM-AC复杂。CaM-AC复杂的低价值,表明强烈的凸轮压实和交流复杂的形式。一致,CaM-AC的水力半径,由AUC为3.3纳米,而不是预期的3.7 nm(数据未显示)。综上所述,这些数据指向一个凸轮CyaA结合的信号通路,形成一个紧凑的1:1异质二聚体。

最后。微生物膜分泌素的克雷伯氏菌oxytoca, PulD, multimeric膜的一个组件所需的复杂高效分泌毒性因素到主机。为了正确地定位细菌膜,PulD associates的伴护蛋白质普尔斯。普尔斯之间的相互作用的S域PulD使用SEC-TD (Sdom)进行了研究。数据如图4所示。

图4。水动力性能Sdom(左面板)和由SEC-TD PulS-Sdom复杂(右面板)分析,显示折射率(实线(左轴),分子质量(实心方块,在右轴)和固有粘度(外开放的广场,右轴)。

分子量测定证实Sdom的形成:普尔斯1:1复杂,22.1 kDa。的固有粘度数据Sdom Sdom:普尔斯复杂mL.g分别为16.9和5.9¹分别。这些数据,耦合的固有粘度值4.4 Sdom Sdom和2.5:普尔斯,强烈建议Sdom形成一个细长的无序结构,而Sdom:普尔斯复杂表单压实,有序的结构。这些数据是由水力半径的值分别为1.7和2.5 nm普尔斯和Sdom,虽然这Sdom:普尔斯复杂的只有2.7纳米。

结论

蛋白信号通路一般错综复杂,涉及许多不同的组件,通常多信号复合物。理解背后的机制hetero-oligomers的形成和homo-oligomers是理解的监管和活动中心这样的复合物。本应用笔记中给出的数据展示了令人信服的信息,可以从使用SEC-TD系统获得。这样的信息,包括单体和复合物的分子量和大小,以及蛋白质结构数据,极大地促进了说明这些多信号通路背后的机制和特点。

工作包含在这个应用程序中注意进一步描述在下列出版物:生物化学,(2010)Vol.49 p.318 - 328;生物。化学、(2011)Vol.286 p.16997 - 17004;生物。化学。(2011)卷,286年,p。38833 - 38843;BMC生物化学(2011)委员会,61年问题。

引用

1. 岩溶et al (2010)。Calmodulin-Induced构象和水动力变化的催化域百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素。,(2010)Vol.49 p.318 - 328。
2. 索托马约尔佩雷斯et al (2011)。Calcium-induced折叠的内在无序Repeat-in-Toxin (RTX)图案通过改变蛋白质和寡聚化州指控。生物。化学。卷,286年,p。16997 - 17004。
3. Nickerson et al (2011)。外膜定位的分泌素PulD蛋白质依靠无序域识别的专用的女伴。生物。化学。(2011)卷,286年,p。38833 - 38843。
4. Benaroudj et al (2011)。装配和蛋白水解处理的分枝杆菌ClpP1和ClpP2。BMC生物化学(2011)委员会,61年问题。