学习如何使用ITC指导蛋白质(RNA) /配体复合物的结晶结晶和解决常见问题。
埃里克•Ennifar Cyrielle Da Veiga,多米尼克•Burnouf Joelle Mezher,芭芭拉Puffer-Enders和菲利普·杜马斯。通讯作者:e.ennifar@unistra.fr架构等Reactivite de l 'ARN生物研究所Moleculaire Cellulaire, CNRS /斯特拉斯堡大学。
复合物的结晶(蛋白质/蛋白质,蛋白质、核酸、蛋白质/配体,核酸/核酸,核酸/配体),即使在良好的生物系统,往往是乏味的和样品时间或消费。复杂结晶的成功率可以显著改善如果适当的初步表征复杂的使用生物物理方法执行。它建立了动态光散射(DLS)是关键评估样本可结晶性(1)。同样,DSC thermofluor-based优化策略开发促进蛋白质/配体结晶(2)。等温滴定量热法(ITC)是“黄金标准”技术为研究分子的相互作用,我们显示,它可以是一个有价值的技术来提高配合物的结晶。ITC是真正的在溶液中直接提供技术,在一个实验中,两个分子之间的完成概要绑定:亲和力(Ka)、焓和熵的变化(ΔH和ΔS)和两个分子之间的化学计量学(N)得到了非常准确(3 - 5)。ITC的主要优势在其他类似生物物理分析方法是,它是不受限制的高分子或低大小上限,没有缓冲的限制,结构研究最重要的是,它不需要任何标签。此外,我们最近发现,现代ITC装置和新加工方法还允许获得一个完整的动力学描述比通常认为的更加多样化的系统,从简单的配体结合到复杂的RNA折叠(6)。
ITC的主要限制是相对大量的示例所需的一个实验。不过这应该不是一个瓶颈结构生物学家涉及到核磁共振或x射线晶体学研究从样本要求非常类似于ITC分析。因为样品没有损坏在ITC实验,它可以恢复和集中为后续crystallogenesis实验。最后,ITC还可以用来评估核酸或蛋白质的正确折叠在一个复杂的使用。我们在这里将这些ITC-guided结晶的一些示例。所有的实验都进行Microcal™iTC200(莫尔文仪器有限公司)。
hiv - 1基因RNA二聚作用起始位点(DIS)是一种高度保守的序列与茎环结构。循环包含一个序列后,促进二聚作用的病毒基因组形成重复重复(kissing-loop)两个DIS之间复杂的发夹。说重复重复复杂的晶体结构(7)揭示意想不到的相似之处与细菌16 S核糖体氨酰网站(网站),这是氨基糖苷类抗生素(8)的目标。因此,结果表明,hiv - 1 RNA还说结合氨基糖甙类,因此可以新药的原理设计一个有吸引力的目标瞄准了hiv - 1基因RNA(9)。在这里,我们将展示如何使用ITC指导一个复杂的由co-crystallization氨基糖苷类利维霉素和hiv - 1 RNA kissing-loop说复杂。
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的DIS /利维霉素交互提供了一个示例salt-dependent绑定,经常与核酸观察。许多核酸配体,氨基糖甙类带正电和不具体的交互是由于静电相互作用主要在低盐浓度。然而,过多的盐浓度的增加可能防止由于静电筛选配体结合。有人可能会因此执行初步ITC实验各种盐条件以减少非特定的绑定,同时保持特定的相互作用。实验在低盐缓冲(25毫米氯化钾,2毫米MgCl2, 25毫米Na甲次砷酸盐pH值7.0)显示两个绑定事件,不能配备一个站点模型(图2)。配件先用两个独立的结合位点模型显示了一个非常紧密的绑定1:1化学计量,按预期(1为每个茎环配体,2 kissing-loop复杂配体),和另一个结合位点的亲和力较低的微摩尔的范围对应于非特定的交互。这种非特异性结合可能因此排除形成同质RNA /配体复杂的结晶条件包含> 100 mM的浓度。然而,在higher-salt条件(200毫米氯化钾2毫米MgCl2 25毫米Na甲次砷酸盐pH值7.0)只观察到特定的和紧密的绑定(图2 b)。这样的实验条件导致同质RNA /配体复杂因此应该优先在寻找结晶条件。
错误折叠是一个频繁的问题在结构研究的RNA。在这里,获得预期的化学计量学也因此这些ITC实验评估的正确折叠RNA,另外,使用正确的抗生素浓度。
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ITC的另一个有趣的观点是化学计量学的实时监控是为了停止实验时所需的RNA /配体比例达到(据说≥1.0)。例如在DIS RNA /利维霉素滴定在200毫米氯化钾,实验时可以停在12日注入RNA与配位饱和(红色箭头)。这种方法应该考虑在化学计量学可以很容易地估计的情况,即当结果乙状结肠相当陡峭的斜坡(Wieseman系数c≥100)当不管常数(koff)应该是缓慢的。在这种情况下,这种方法可以防止过多的配体的存在与最优执行示例和结晶RNA /配体复杂的比率。
我们使用以下标准的例子与未经优化盐浓度对DIS kissing-loop RNA /利维霉素交互(ITC缓冲用150毫米氯化钾,5毫米MgCl2, 20毫米钠甲次砷酸盐,pH值7.0)。RNA序列使用chemically-synthesized 23-nucleotide长和hiv - 1亚型说包含bromouridine第三位置(7)为了促进晶体结构测定使用多波长反常色散(疯狂)的方法。在120µM RNA样本浓度(RNA链)准备在ITC缓冲区和放置在ITC细胞。注射器充满了利维霉素2.4毫米在ITC缓冲区。ITC执行分析12°C为了提高复杂地层(因为是放热的交互)和保留的RNA可能退化。
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ITC实验后,复杂的形成在ITC细胞恢复和集中三倍(在4°C保护RNA /配体相互作用)到400使用microcentratorsµM。这个解决方案然后混合体积(1/1)在结晶托盘使用商业结晶稀疏矩阵屏幕(包含96个不同结晶条件)和结晶的机器人。结晶水库满是稀疏矩阵的解决方案和托盘放置在37°C孵化。大单晶适合衍射(1.6决议使用同步x射线源)和结构测定(图4)将增长16-24h孵化后用汉普顿研究®Natrix HT稀疏矩阵条件(图4)。
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Riboswitches信使核糖核酸的翻译地区,结合特定的代谢产物。绑定后,观察构象转变,从而调节蛋白的表达参与riboswitch基质(12)的生物合成。E。杆菌ThiC TPP riboswitch响应辅酶硫胺素焦磷酸(TPP),一个活跃的形式的维生素B1(13)(图5)。在本例中我们使用85 -核苷酸合成RNA片段对应Ecoli TPP适配子域(6)。的一个主要问题,而大型RNA与复杂的二级和三级结构恢复正常折叠分子生产过剩后,净化,体外复性过程。
在第一步,尝试以下重折叠协议(RNA批1):净化后,RNA是heat-deturated flash-cooled冰和放置在ITC缓冲用钠甲次砷酸盐pH值6.5 50 mM,乙酸钾100毫米,醋酸镁5毫米。RNA折叠后,执行一个ITC实验25°C: RNA 30µM放在ITC细胞和注射器加载500µM TPP。ITC实验显示,只有约一半的RNA能够TPP配体结合,这是一个严重的错误折叠问题的强烈指标的RNA(图5,中间,见“批1”)。RNA / TPP复杂细胞形成的ITC恢复,集中和用于结晶试验为hiv - 1 RNA DIS kissing-loop如上所述。然而,从这些结晶化验只观察到明显下降(图5,左下角),与假设一致的主要部分RNA是错误折叠。
在第二个步骤中,RNA折叠协议改变了:热变性后在H。90°C 3分钟2O, riboswitch冷却到室温40分钟。10 x ITC缓冲区被添加到最后一个1 x浓度和混合在室温下进一步孵化了40分钟。一批ITC实验进行第二个RNA(30µM RNA, 500µM TPP)表明,该RNA折叠协议导致一个完全活跃riboswitch以来100%的RNA能够绑定TPP配体(图5,中间,见“批2”)。结晶浓度和设置后下降,大单晶衍射5决议获得(图5,右下角)。这清楚地确定的利益使用ITC作为质量控制的复杂形成之前设置结晶试验。
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细菌的DNA聚合酶持续合成因素,或β滑动夹,是为赋予高持续合成DNA DNA聚合酶和其他因素参与新陈代谢,通过它们之间的交互(通过一个小守恒的肽的疏水口袋夹(14)。合成短肽已经发展为了干扰这种交互,以防止绑定滑动压板的DNA聚合酶,因此作为抗生素(15)。本研究的目的是cocrystallize P。绿脓杆菌夹绑定到一个合成肽结构洞察这个互动和帮助新抗生素肽的基于结构的原理设计一个更好的亲和力。结晶之前,一个ITC实验是由将β滑动压板(35µM消息灵通的pH值7.4 10毫米,氯化钠150毫米,EDTA 3毫米)在ITC细胞和肽(300µM)注射器(图6)。这个复杂的进一步用于结晶试验后使用microcentrator 47个毫克/毫升浓度。结晶是由混合一个卷组的蛋白质/肽复杂储层解决方案的一个卷由0.1米钠Mes pH值6.0 100毫米,氯化钙100毫米和20 - 30% (w / v)聚乙二醇(PEG)的400年。经过数天的孵化20°C,大单晶衍射2.2使用同步辐射是获得(图6 b)和x射线结构解决了(图7)。
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ITC技术可以实现在生物大分子复合物的结晶工作流,可以用作指导改善结晶的成功率:
样品结构研究适合ITC分析要求
评估真正的活性蛋白质和/或配体浓度(化学计量学观察提供的)
优化的实时测定蛋白质/配体比用于结晶的复杂的通过监控化学计量学
帮助优化的复杂地层(样本同质性、亲和力、特异性)
完成概要热力学的交互提供“免费”。ITC后一只需要集中样本分析。
Ferre-D 'Amare, a。R。烟草,s . k .(1994)使用动态光散射评估可结晶性高分子和大分子组装,结构2,357 - 359。
Dupeux F。桨手,M。Seroul, G。,吸干,D。马尔克斯,j . A .(2011)热稳定性测定有助于估计生物样品的结晶的可能性,Acta Crystallogr D Crystallogr杂志67,915 - 919。
Ladbury, j·E。Chowdhry, b z(1996)感应热:等温滴定量热法的应用热力学研究生物分子相互作用,化学生物3,791 - 801。
莱维特,S。Freire,大肠(2001)直接测量的蛋白质绑定能量通过等温滴定量热法,当今结构生物学观点》11日560 - 566。
Privalov, p . L。德拉甘,人工智能(2007)生物大分子的微量热法,Biophys化学126 - 24。
Burnouf D。Ennifar E。、Guedich年代。河豚,B。霍夫曼,G。Bec, G。Disdier F。Baltzinger, M。杜马斯,p (2012) kinITC:新方法获得等温滴定联合热力学和动力学数据量热法,J是化学Soc 134年,559 - 565。
Ennifar E。沃尔特,P。,Ehresmann B。Ehresmann C。杜马斯,p(2001)晶体结构堆叠亲吻复合物同轴相连的hiv - 1 RNA二聚作用起始位点,Nat结构生物学观点》8,1064 - 1068。
Ennifar E。Paillart, j . C。Marquet, R。,Ehresmann B。Ehresmann C。小仲马,P。沃尔特,p (2003) hiv - 1 RNA二聚作用起始位点结构类似于核糖体是一个网站,结合氨基糖苷类抗生素,临床生物化学278,2723 - 2730。
Bernacchi, S。、Freisz年代。Maechling C。,这位B。Marquet, R。小仲马,P。,Ennifar大肠(2007)氨基糖苷类绑定到hiv - 1 RNA二聚作用起始位点:热力学和影响kissing-loop双向转换,核酸Res。
Ennifar E。杜马斯,p(2006)多态性凸出来的残留在hiv - 1 RNA说接吻复杂与解决方案的研究和结构比较,J杂志356,771 - 782。
Ennifar E。Paillart, j . C。Bodlenner,。沃尔特,P。韦贝尔,j . M。Aubertin, a . M。,苍白,P。小仲马,P。,Marquet r(2006)针对二聚作用起始位点的hiv - 1 RNA与氨基糖甙类:从晶体到细胞,核酸Res 34岁,2328 - 2339。
温克勒,w . C。断路器,r . r .(2005)的监管riboswitches细菌的基因表达,为Microbiol 59, 487 - 517。
温克勒,W。Nahvi,。断路器,r . r .(2002)硫胺素衍生品直接绑定信使rna调节细菌基因的表达,自然419年,952 - 956。
Burnouf, d . Y。Olieric, V。瓦格纳,J。藤井裕久,S。Reinbolt, J。福克斯,r . P。杜马斯,p(2004)的结构和生化分析滑动压板/配位体的相互作用表明复制之间的竞争和translesion DNA聚合酶,J杂志335,1187 - 1197。
沃尔夫,P。Olieric, V。、Briand j . P。Chaloin, O。Dejaegere,。小仲马,P。Ennifar E。Guichard, G。瓦格纳,J。Burnouf, d . y(2011)基于结构设计的短肽配体结合到大肠杆菌持续合成环地中海J化学54岁,4627 - 4637。
沃尔夫,P。阿玛尔,我。Olieric, V。Chaloin, O。Gygli, G。Ennifar E。,Lorber B。Guichard, G。瓦格纳,J。Dejaegere,。Burnouf, d . y(2014)肽的微分模式绑定到复制的滑动夹子从各种细菌的起源,J地中海化学57岁,7565 - 7576
