预制剂和稳定性的研究使用DSC biotherapeutics |莫尔文Panalytical

在这个应用程序中注意,莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC已被用于快速筛选处方前工作缓冲区的开发和优化的存储条件的抗体在过程开发。结果对应与那些通过其他更费时的方法。

介绍

biotherapeutics的使用,如抗体和其他蛋白质分子,治疗疾病制药行业是一个快速增长的领域。Biotherapeutics往往需要在高浓度和多个剂量,因此制造商必须产生公斤数量或更多的蛋白质药物。biotherapeutics的制造过程包括蛋白质表达数千升的生物反应器中紧随其后的是一个净化的过程使用大规模层析柱和过滤系统。

蛋白质的稳定工艺条件,构象变化的可逆性,任何形式聚集倾向取决于pH值和缓冲等因素组成。全面了解这些因素对工艺条件的选择很重要,制定和分析方法的发展。抗体纯化过程中的步骤可以使蛋白质不稳定包括低pH值洗脱步骤一列,对于病毒失活低pH值保存步骤,任何阶段包括pH值和/或离子强度调整,包括最终配方。

差示扫描量热法(DSC)提供信息的条件下蛋白质的热稳定性不同的pH值和cosolutes,通过监测热过渡中点,T_米。一个更高的T_米反映了更高的热稳定性,与长期稳定性相关。本应用笔记描述Diosynth生物技术使用热稳定性数据从DSC描述抗体在初始pH值的稳定性和缓冲筛查预制剂开发和优化生产过程中使用的低pH值病毒失活。低pH值病毒蛋白质失活是可取的制造业提供它不会引起任何减少蛋白质的稳定性。

材料和方法

DSC进行使用莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC系统。预制剂发展研究一系列的缓冲与pH值3至8。蛋白抗体(X)是存储在每个缓冲区,并立即进行了化验(t = 0),一个星期后的存储(t = 1周)。

净化环境的优化、DSC热分析图的抗体Y(中性三羟甲基氨基甲烷缓冲液中含有氯化钠和EDTA, pH值7.4)研究了柠檬酸和pH值相比3缓冲和柠檬酸缓冲调整pH值6和2 M三,pH值9.0。

温谱图缓冲区仅是减去之前从每个蛋白质分析使用起源™7.0软件配备MicroCal VP-Capillary DSC分析软件。

结果与讨论

初始pH /缓冲筛查在预制剂开发

主要的值T_米峰值在t = 0抗体X 19缓冲预制剂发展的最初的研究是图1所示。抗体的DSC热分析图两个缓冲区如图2所示。从Tm值,最稳定的缓冲条件发现酸碱5.0和7.5之间。在t = 0时,其他分析方法(紫外、尺寸排阻色谱法(SEC),光散射,和sds - page)显示更少的歧视之间的缓冲条件相比DSC(数据没有显示)。

图1:Tm的抗体值X的处方前工作缓冲区。样本分析的莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC在t = 0。

T½值被用来进一步区分条件,如图2所示。T½峰值宽度最大的一半高度的重大转变的DSC热谱和通常反映了co-operativity热转变。较低的T½价值可能表明一个更紧凑的结构,因此首选配方。这里,最低的T½值被发现缓冲区与pH值在5.5和6.5之间(图3)。

图2:DSC热分析图的抗体X t = 0。(一)溶解在柠檬酸缓冲液pH值3.0 (B)琥珀酸溶解在缓冲pH值6.0。Tm和T½值显示。

图3:一系列T½值预制剂的主要抗体X Tm过渡缓冲区在T = 0, T = 1周。

低pH值控制步骤和中和

柠檬酸缓冲在pH值3是一个候选人都使用的抗体蛋白的洗脱亲和柱和随后的低pH值保持一步病毒失活。由于大部分的蛋白质往往变得不稳定下长时间暴露于这种低pH值,pH值必须提高病毒失活后一步。

抗体的DSC扫描缓冲区中性酸碱和3图4和图5所示。

图4:DSC热谱的抗体在参考缓冲区(三、氯化钠、EDTA、pH7.4)。DSC热谱显示三个热转换。这种热模式是常见的抗体。

图5:DSC热谱的抗体在低pH值保持缓存(柠檬酸,pH值3.0)。抗体的DSC热谱pH值3.0显示热稳定性的丧失由于减少T_米价值观:T_米 ¹从降低60.4°C到48.0°C, T_米 ²从降低73.3°C到57.8°C,和T_米 ³不再是明显抗体在pH值3.0缓冲区。

的形状和模式的差异两个温谱图演示了热稳定性的pH值3.0中的抗体缓冲区。峰高的T_米²过渡是降低,峰值之间的定义是广泛的,第一次和第二次转换在pH值3.0不太明显比pH值7.4。

模仿pH中和步骤中,抗体溶液的pH值调整与集中三羟甲基氨基甲烷溶液液pH值6.0在pH值9。产生的抗体量热解决方案是如图6所示。这里,增加热稳定性相对于抗体在pH值3.0缓冲区。T_米²和T_米³抗体的pH值6.0解决方案类似于T_米²和T_米³抗体的参考缓冲区。整体形状、峰值定义,pH值和峰宽6抗体情况也类似于参考pH值7.4。

中和也可以在完成稳定辅料,如组氨酸。在这种情况下,热的抗体中和组氨酸的存在几乎相同的图6,为这个特定的抗体,表明组氨酸没有提供任何重要的稳定作用。