实现kinITC AFFINImeter

特约作者:

菲利普·杜马斯[1],Eric Ennifar[1],纪尧姆Bec[1],天使Pineiro[2、3],胡安Sabn[2],伊娃穆尼奥斯[2],哈维尔·里尔[2])

[1]生物物理与结构生物学的团队,IBMC, UPR9002 du CNRS,斯特拉斯堡大学。

[2]AFFINImeter科学&开发团队,软件4科学发展,美国l Ed, Emprendia校园维达,西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉,15782年加盟。

[3]部门应用物理的前沿空中管制官。物理,圣地亚哥德孔波斯特拉大学校园维达,西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉,15782年加盟。通讯作者:p.dumas@unistra.fr

介绍

人们普遍认为,ITC是一个典型的热力学技术不适合提取动力学信息。因此普遍反对ITC SPR因为后者是一个动力学技术卓越。然而,这充其量是一个简化自ITC是基于动态测量。事实上,原始信号测量在任何热功率(在ITC实验µJ s¹或µcal s¹),本质上是热的速度生产,而不是热本身发展的反应。显然,这种热量的速度生产直接相关的动力学反应发生在测量细胞,这就是为什么微热量计可能是远远超过只是一个“热量表”。这是符合普遍观察到有系统显示每次注射后迅速回到基线,这是一个快速的到达平衡时间,和其他人,相反,显示缓慢,甚至非常缓慢,回到基线。它不应该是一个惊喜,因此,美国国际贸易委员会已被用来推导动力学信息。然而,很多读者可能会惊奇地发现,第一个“补偿方式”量热器的祖先(MicroCal VP-ITC和MicroCal ITC200仪器)于1924年设计,使用第一个测量产生的热功率苍蝇[1,2]。因此,第一个“补偿方式”量热计是用于我们现在称之为kinITC实验。

在化学和物理化学,之间的联系测量热力的动力学反应一直是理论研究的主题[3 - 5]。然而,工具的可能性,特别是由于大量样本的几毫升和响应时间长,相当有限,测量只局限于慢,有时很慢,反应[6]。

在生物领域,因此,大多表现在酶学动力学测量Sturtevant发起于1937年的开创性工作[7](审查)。现代仪器像MicroCal ITC200 200 -µl测量细胞和响应时间比10(3.5秒MicroCal ITC200仪器用于这项研究)为我们提供更容易解决生物问题的可能性不限于酶研究。这样的响应时间可以来源于甲醇稀释实验下面描述。有趣的是,最近的一项研究表明,缓慢的RNA折叠VP-ITC也可能是宝贵的[8]。本应用笔记的目的是展示如何以及何时可以从ITC功率曲线动态信息检索。这里显示的结果获得从Wolfram研究数学与程序开发,来实现和验证方法。底层算法都引入AFFINImeter他们预计由2015年4月公开。

一个完整的完成kinITC方法[9]中给出。这里,我们将做一个简短的总结,强调一个简化版本,可以产生非常好的结果就一个经典ITC数据分析已经完成。必须强调,在[9],我们考虑的应用kinITC在两种不同的情况下,首先对一个简单的一步动能方案表示为:

A + B↔C参数k_在k_从(1)

为两步,第二,动能方案与绑定事件,后跟一个构象变化(“诱导契合”)。在当前应用程序中,我们只关注一步动能方案由方程(1)。从本质上讲,kinITC是基于连接反应的动力学和热测量电池的电力生产。基本动能考虑收益率:

dC / dt = k_在(一)₀AB-k_从C (2)

在A、B和C是简化符号为降低浓度(一)/(一)₀[B] /[一]₀和[C] /[一]₀,(一个)₀被滴定的浓度测量细胞注射之前的滴定剂B这个微分方程是有效的在任何一步滴定(例如“注入”),但只有复合B注入后,确保了系统的“关闭”,以下守恒方程应用:A + C =常数和B + C =常数。在注入体积小δV(复合B,相反,B和C的变化,也影响B和由此产生的稀释(每个添加卷δV取代相同的体积δV从细胞),这使得方程(2)不足以描述这个系统。AFFINImeter完全解决这些技术问题,但他们不理解kinITC必不可少的,因此我们将只关注系统的进化后立即复合B被注入。

之间的联系dC / dt和热功率信号P_年代在任何时间t后注入复合B是容易得到:

P_年代V (t) =_细胞ΔH[一]₀dC / dt (3)

在V_细胞是细胞体积(200µL MicroCal ITC200 VP-ITC和1.4毫升)。因此,当从集成dC / dt就是方程(2)(见[9]),P_年代可以评估(t)。注意:P_年代(t)不是测量热功率P_米由于有限的响应时间(t)(或弛豫时间)τ_{美国国际贸易委员会}的仪器。之间的联系和由古典卷积方程表示:

P_年代(t) = P_米(t) +τ_{美国国际贸易委员会}dP_米/ dt (4)

这个方程,自1933年以来一直被称为田方程在量热法的框架(可以参考,请参阅[3,10]),实际上是一个通用方程描述一个有限的响应时间的影响在任何仪器线性响应。显然,短τ_{美国国际贸易委员会},扭曲了被测信号越少。我们将考虑在以下kinITC起源于一个非空的极限τ_{美国国际贸易委员会}价值。来洞察这一重要的影响参数对注入的形状曲线,见http://www-ibmc.u-strasbg.fr: 8080 / webMathematica / kinITCdemo /。重要的是,任何的价值τ_{美国国际贸易委员会}方程(4)表明,P的集成_米(t)和P_年代(t)会导致相同的总热量,但只有一个注射之间留下了足够的时间回到平衡的信号(见下文)。

通过实验,τ_{美国国际贸易委员会}可以通过拟合获得P_米(t) = P_马克斯exp (- t /τ_{美国国际贸易委员会})仪器的响应衰减非常快热激发这样的快速注射后稀释的甲醇(1µl注射1 - 3% v / v甲醇)。由“衰减响应”我们指的是短瞬态信号的反应结束后由于励磁本身。为MicroCal ITC200,这允许获得τ_{美国国际贸易委员会}≈3.5 s。注意,不同仪器,仪器可能存在有一定的变化。最后,它应该提到,严格,单一弛豫时间可能不足以描述完全响应乐器(4、5、10)。我们不需要考虑这些细分的目的。

一个人怎么能判断动态信号的存在热功率曲线?

经常检查连续注射时,很容易看出一个重大变化所需的时间θ回到基线,或者换句话说,平衡的时间。特别是,相对应的注入,或接近,mid-titration(即[A] = [B]当一个结合位点)显示了平衡时间慢。这是说明与计算数据在图1。这种特性是一个明显的标志一个动态信号的存在。直观的解释是,接近mid-titration, A和B的浓度较低(甚至很低如果亲和力高),它减缓了二阶反应动力学方程(2)。因此,它是至关重要的,留下足够的时间记录在这些mid-titration注射用更长的平衡时间。

图1:进化的时间回到基线(平衡时间)。注射曲线(左面板)的计算值(一个)₀= 11µm [B]₀= 120µM, k_在= 10⁴米¹年代¹k_从= 10³年代¹(K_d= 0.1µM),τ _{美国国际贸易委员会}= 3.5,τ _混合= 0.8 s。注入体积是0.3µl第一注入(注射时间0.6 s)和2.3µl否则(注入乘以4.6 s)。两个面板上的紫色曲线对应的注入mid-titration([一]= [B]),右边的蓝色曲线面板对应于第一个注射(注意,与真实的数据受到噪声的影响,可能会适当的考虑θ₂第二次注射而不是θ₁从第一个低烈度注入)。的箭头θ ₁和θ ₉=θ _马克斯突出的发展平衡时间从第一注入mid-titration注入。的值θ ₁= 59年代和θ ₉=θ _马克斯= 221年代被自动评估程序AFFINImeter领导密切本来会选择“通过眼睛”(相关的可靠估计不确定性也是自动提供)。

一个简单的方法可以用于判断一眼如果存在于一个ITC实验的一些动态信息。如果连续注射的形状保持不变(分离变量振幅),然后每个注入的完整的振幅是其综合价值成正比,而如果注射的形状改变显著,这个比例是迷路了。这是图2所示不同计算数据集k_在进化从10⁴到10⁶米¹年代¹和K_d100海里。清楚地看到,当动力学变得非常快(k_在= 10⁶米¹年代¹每个注射),平衡时间是恒定的,因为它本质上是由τ_{美国国际贸易委员会}(仪器响应太慢)和曲线从正确获得按比例缩小的集成加热信封几乎完全来自每注射曲线形状。相反,越来越离开时两条曲线之间k_在变得越来越小,即当一个动态信号越来越明显。这两条曲线的比较是通过AFFINImeter系统。

图2:评估如果存在一个动态信号通过对比注射滴定曲线的包络曲线。所有理论计算数据集在图1中,使用的值表示的值分开k _在。每个集成热功率曲线(用红色,右边纵坐标每个情节的一部分),是按比例缩小的重叠的第二次注射曲线(蓝色)在综合热(红点)。紫色是最接近mid-titration注射曲线(即[A] = [B])。注意,热权力变量k的变化造成的_在,但不是集成加热,不依赖于动力学参数。的值Θ= (k _从 k _在(一)₀)^1/2 τ _{美国国际贸易委员会}指出随着k _在(见讨论Θ的意思)。

到达平衡时间曲线(等)的收益率k_在和k_从

这是所示[9](补充信息)分析基于方程(2)描述了如何合理平衡稳定时间的变化,θ_k从注射到注入。估计的时间特征τ回到基线任何注入了:

(5)

在哪里c= []₀/K_dWieseman参数和s = [B]_合计/(一)_合计是当前的化学计量比注入。事实上,回到基线不是指数由于反应的双分子的角色,这意味着一个时间τ不能完全代表整个回到基线。然而,τ由方程(5)几乎是有用,因为它等于最慢的组成部分这回到基线。考虑到大约仪器响应时间,τ应该增加τ_{美国国际贸易委员会}。因此考虑一个时间间隔相等的倍数(τ+τ_{美国国际贸易委员会})达到在实践中,如果不是在理论上,结束的注入。我们发现一个不错的选择是4.5 (τ+τ_{美国国际贸易委员会})。最后,后者估计也应该增加注入时间t_注入,几秒钟。通过比较每个喷射理论预期的有效长度是从4.5 (τ+τ_{美国国际贸易委员会})+ t_注入一个可以确定k_从,因此也k_在自K_d是已知的。“平衡稳定时间曲线”(等)与图1的数据计算得到如图3所示。

图3:平衡稳定时间曲线平衡乘以θ_k(紫色圆点,k =注入#)测定从理论注射曲线解释图1的传说。固体蓝色曲线和蓝色的点对应于4.5 (τ+τ _{美国国际贸易委员会})+ t_注入,在那里τ由方程(5)给出的参数用于计算理论数据如图1所示。

看来,θ的倍_k来自数值模拟是合理的协议与来自方程(5),一个人可能因此利用*θ_k获得实验从AFFINImeter kinITC模型评估k_在和k_从一旦获得了离解常数。应该强调k_从是唯一的自由参数拟合实验等与方程(5),这使得这个过程非常健壮。注意,类似的考虑[11]中描述。

获得的经验法则k_从迅速从一个实验等

一个实验等提供了一个非常简单的方法来估计k_从。从方程(5)可以推导出对理想仪器(即零响应时间)k_从≈θ₁/θ²_马克斯,θ₁和θ_马克斯定义如图1所示。考虑到响应时间导致了粗略的估计k_从≈(θ₁-4.5τ_{美国国际贸易委员会})/(θ_马克斯-4.5τ_{美国国际贸易委员会})²这意味着仅仅是外观检验的实验等,没有任何的知识从通常的处理结果,粗略估计k_从可以获得。因为它的简单方法是如此有吸引力,每个人都应该记得,只有有效的简单的动力学方程(1)的方案是有效的。也不应指望一个可靠的结果与噪声等,特别是最大等还不清楚。应用这种快速方法的理论数据图1导致k_从≈(59 - 4.5×3.5)/ (221 - 4.5×3.5)²= 1.02×10³年代¹这是这里的值非常接近10吗³年代¹在模拟中使用。

结果与实验数据

测试的效率简化kinITC方法组成的一个实验性的形状等与方程(5),我们认为是碳酸酐酶的抑制剂4-CBS的绑定。这个实验系统很好以表面等离子体共振(SPR)基准涉及几个实验室[12]。我们因此ITC进行实验与MicroCal ITC200在同一条件中描述的SPR研究中,除了对一组不同的温度和更高的酶和抑制剂浓度。的MicroCal ITC200是高增益的操作模式和搅拌速度是每分钟1000转。碳酸酐酶和4-CBS从σ和酶准备购买表示[12]。我们执行五个实验为6.1,9.1,12.1,15和25°C测量细胞的酶(复合)。初始浓度的酶是(一个)₀= 26µM(分开了19µM 25°C)的抑制剂和初始浓度的滴定注射器是[B]₀= 315µM温度。注入卷0.3µl第一注入和1.9µl以下注射1.4(除了µl 25°C)。每注射是在0.5µl年代¹。注意,积分时间之间的时间(即连续功率测量)被设置为2 s,这是明显低于默认的5 s。这是重要的,允许足够的采样后迅速变化的热功率的一部分的开始注射(注意与新MicroCal PEAQ-ITC乐器,这不再是一个问题,因为电力数据总是采样1 Hz)。结果的一个子集的原始注入曲线、滴定曲线和比例如图4所示。

图4:子集AFFINImeter的结果。:插图的原始注入曲线获得MicroCal ITC200(更好的可视化的颜色只是注射)。中间:AFFINImeter获得的滴定曲线。注意,基线校正和错误决定的过程是全自动的。在这些特殊的情况下,过去四注射(紫色部分),非常适合用于heat-of-dilution修正,但更普遍的方法自动AFFINImeter中可用来处理这个问题。周围的小紫圆第一注入点为9.1°C指出这一点被自动拒绝了拟合过程。底部:实验和理论比例。实验平衡时间和他们的错误会自动由AFFINImeter决定。误差是提高注射mid-titration后吵着。

从实验的ETCs我们获得k_在和k_从温度和我们将这些值与SPR与阿伦尼乌斯两块(图5)。似乎从kinITC前,行SPR 1 nk_在与T¹一方面,对于1 nk_从与T¹另一方面,如果不叠加,在实验错误是平行的。这意味着比率k_在^SPR/k_在^kinITC和k_从^SPR/k_从^kinITC不同小6 - 25°C (k_在^SPR/k_在^kinITC≈k_从^SPR/k_从^kinITC≈2)尽管k_在不同2.4折,k_从不同温度范围内常见的5.5折两个实验。例如,在6°C的值:

k_在^SPR= (1.5±0.2)×10⁴米¹年代¹,k_在^kinITC= (0.69±0.07)×10⁴米¹年代¹

k_从^SPR= (4.3±0.4)×10³年代¹,k_从^kinITC= (2.8±0.3)×10³年代¹

在24°C:

k_在^SPR= (3.5±0.4)×10⁴米¹年代¹,k_在^kinITC= (1.4±0.16)×10⁴米¹年代¹

k_从^SPR= (32±3)×10³年代¹,k_从^kinITC= (14±2)×10³年代¹

(后者kinITC值推断从25°C)。

的温度依赖性k_在和k_从因此完全取决于kinITC,这意味着激活能量ΔH吗_在^×和ΔH_从^×从实验中的两种技术是相同的错误(参见图5)。这也意味着离解常数K_d^SPR和K_d^{美国国际贸易委员会}几乎是相同的在所有温度下(验证在[12]只有一个温度)。系统差异的2.5倍(远远超出实验错误)之间的动力学参数kinITC SPR,目前,没有解释。值得注意的是,它没有结果的使用简化ETC-based kinITC技术由于我们获得本质上相同的结果(图中未显示)通过使用完整的[9]中描述kinITC技术,是通过同时拟合所有注入的形状曲线的实验。

图5:阿伦尼乌斯的阴谋k _在和k _从从kinITC和SPR文本)

讨论和结论

简化ETC-based kinITC技术被证明是有效的为我们提供动态信息以及无可争辩的热力学信息。kinITC显然是很大的优势,它不需要任何特殊制备样品,同时,它是一个真正的“label-free”和真正的溶液中的技术。一个实用的地面上,算法中引入AFFINImeter允许获得瞬间动力学参数一旦原始注入曲线处理。显然,这将是值得研究的细节(s)的原因系统kinITC和SPR的结果之间的差异观察碳酸酐酶/ 4 cbs系统。

我们通过数值模拟检验的固有局限性,由于有限的仪器的响应时间(图2)。在最初出版[9],定量标准是通过无量纲参数Θ:

Θ= (k_从k_在(一)₀)^1/2τ_{美国国际贸易委员会}=k_从c^1/2τ_{美国国际贸易委员会}(6)

在协议与数值模拟,可以说,Θ应该小于1。在实践中,准确的最大值被认为并不普遍,因为这取决于注射曲线的质量。因此取决于ΔH的反应,但也最重要的是在所有实验方面影响这质量,特别是缓冲区的严格的身份在测量细胞和注射器,和严格尊重清洁程序的工具。在没有额外的调查,它是安全的考虑Θ< 0.5。Θ值获得碳酸酐酶的范围从0.08 0.23 6.1°C到25°C,在与上述标准完美的协议。

最后,我们想强调的两个重要的点。首先,kinITC(和其他动力学技术)是依赖于模式。必须记得,热力学无法区分两种动力学机制和帮助,因此,可能有必要证明由独立意味着使用的动力学模型的有效性。当然,整个kinITC技术(同时符合的注入对所有实验曲线)可以其中一个手段,但这可能不足以获得一个明确的答案在两个替代模型。其次,应该召回,一个两步动能方案(如果实验验证)服从kinITC[9],但只有完整kinITC技术。该方法成功地用于研究动力学调控基因的表达的所谓“riboswitches”位于上游翻译区(5 ' utr)的细菌信使rna。这是第一次暴露在[9]和其他结果很快就会公布。这些方法也将在AFFINImeter可用。

引用

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