本应用笔记将描述三个抗体的分析样本使用列校准和多探头秒。之间存在着比较数据来源于两种方法强调先进检测的优点。
抗体产生浓厚兴趣的制药/生物制药/ biotherapeutic行业由于其能力直接中和攻击向特定结构有害的代理。作为一类天然分子,发展了,现在允许科学家在实验室设置产生抗体。因为抗体的功能取决于其分子结构和完整性,完整的描述,包括分子量大小和纯度,这些材料是保证疗效的关键。
凝胶排阻色谱(SEC),也称为凝胶渗透色谱法(GPC),是一种广泛使用的技术描述一系列样品,批量生产的材料蛋白质和其他生物大分子,如抗体。这种技术可以用来测量分子量的时刻,分子量分布,这些材料的固有粘度和水动力大小。图1显示了一个完整的莫尔文OMNISEC SEC系统设置。
简要概述证券交易委员会是如何工作的:溶剂化样本是由液体流动相通过分析柱的多孔凝胶粒子,发生diffusion-controlled分离大分子组件的位置,最终观察到不同的探测器每片样品洗提。样品洗提根据分子大小,大的分子洗脱。重要的是要记住,洗脱顺序是根据分子大小和分子量。
SEC的效力取决于哪些探测器耦合分析的色谱法。两种常见的秒配置是一个列校准秒设置,和一个先进的检测秒设置。一列校准SEC系统采用单一浓度检测器,通常折射指数(RI)或紫外检测器,比较分析物的保留体积分子通过证券交易委员会(SEC)对一系列的标准列与已知分子量。常见的先进检测交会配置利用国际扶轮的组合,UV / Vis光电二极管阵列(PDA)、粘度计、光散射检测器进行直接测量样品的分子量、特性粘度和分子大小、独立的保留体积或洗脱顺序。
本应用笔记将描述三个抗体的分析样本使用列校准和先进检测秒。之间存在着比较数据来源于两种方法强调先进检测的优点。
图1:莫尔文的OMNISEC tetra-detector SEC系统。
三个抗体样本,1、2和3,准备在水的浓度约为0.5毫克/毫升交会分析使用莫尔文OMNISEC系统。样品进行了分析使用2×P3000磷酸盐(PBS)的流动相的流速0.75 mL / min。“零废物”模式volume-economic样品交付注入100µL每个样本。autosampler、列,探测器隔间都维持在整个分析25°C。
tetra探测器抗体样品的色谱图如图2 - 4所示。国际扶轮信号提出了红色,280海里的UV / Vis PDA信号是紫色,粘度计信号是蓝色的,直角光散射检测器是绿色的。LogMW提出了黄金线。
图2:利乐探测器样品色谱图1所示。
图3:利乐探测器样品色谱图2所示。
图4:利乐探测器样品色谱图3所示。
所有三个样本显示良好的色谱法,就是明证探测器信号回到基线。做一个粗略的检查,每个样品的保留体积表明样本3洗提最低洗脱体积(最早的洗脱时间),紧随其后的是样品1,最后样品2。这一趋势是强调覆盖的折射率色谱图如图5所示。
图5:覆盖的折射率色谱样品1(红色),2(紫色)和3(绿色)。
结论可以从这个比较样本3具有最大的分子大小的三个样品,紧随其后的是样品1和样品2的最小分子大小。重要的是要注意,术语分子大小被用于制造比较基于洗脱顺序,不是吗分子量。在许多情况下,分子大小和分子量遵循相同的趋势,但这并不是所有样本完全正确。
在下面几节中,将讨论列校准数据和先进的检测。为了提供一个公平的比较列校准和先进的检测分析方法,相同的色谱数据用于两组计算。
蛋白质分子量标记工具包(西格玛奥德里奇)由六个球状蛋白质和一个排阻极限标记准备在PBS的浓度大约1 - 3毫克/毫升为了提供分子量资料列集。蛋白质的分子量范围从29 kDa 669 kDa。生成的校准曲线如图6所示。
图6:从六个蛋白质生成校准曲线建立了分子量的价值观。
抗体的分子量和分散度值计算样本1,2,3基于蛋白校准曲线展示在表1所示。
表1。分子特性的数据列校准样品1,2,3。
如预期基于洗脱量如图5和图6中的校准曲线下降的事实与保留体积增加,低分子量分子量计算示例3最高,约为202 kDa。下一个示例1 143 kDa,最后是样品2 97 kDa。基于校准曲线如图6所示,这个范围内的分子量是一致的保留体积差异超过1毫升(-17.2 ~ 16.1毫升)峰的样品3的示例2的峰值。用一个探测器列校准证交会方法,这种相对分子量,在相对于蛋白质标准用于创建校准曲线,是分子数据的程度。
进一步检查这些样品,从先进分子表征数据检测样品1、2和3(见图2 - 4)表2中所示。浓度与粘度计探测器和光散射检测器提供了更全面的数据,包括绝对分子量(Mw),分散度(Mw / Mn),内在粘度(IV)和水力半径(RH)。dn /直流0.185,用于分析典型的蛋白质在水媒体。
表2。从先进的分子表征数据检测样品1,2,3。
明显的区别从获得的数据列校准和先进的检测是相对分子量计算列校准提供了一个范围的值的三抗体样本,而绝对分子量先进检测正确的数据显示,这三个抗体样本有相同的分子量,大约150 kDa。的分散性值大约同意平LogMW跟踪在图3 - 5和表明,这些样品是离散的物种。先进的检测数据也支持分子大小趋势观察的洗脱顺序在图5中,如示例3第四最高、规模最大的RH价值,其次是样品1,最后,样品2。这意味着三个抗体分子形状不同,那些形状和大小差异,不是分子量的差异,导致它们在不同保留卷洗提
如果这些抗体的分析样品仅仅依赖列校准数据,获得的分子量信息是不准确的。例如,研究人员可能会得出错误的结论,抗体样本2较低分子量的损失由于L多肽链或抗体样本3它杂质或聚合。当在现实中这两个已经发生,不同大小的分子是由于不可预见的结构或构象变化的差异。使用先进的检测,采用光散射检测器测量的绝对分子量独立保留体积,提供准确的分子量数据和显示结构细节不可见列校准技术。额外的例子强调需要先进的检测,以获得准确的分子信息样本组件,请参阅相关应用注:描述的免疫球蛋白单体和聚合。
本应用笔记中的数据说明了最重要的一个先进的检测校准秒秒。而列的好处已被成功地用于许多年来,它依赖于危险的假设分子量总趋势与分子大小,从而保留体积。虽然许多材料表现出这种趋势,有很多变量的大分子结构,如抗体所示,没有。列校准证交会分析这些类型的材料可能会导致显著错误的定性和定量数据和结论。先进的探测器交会不仅可以测量绝对分子量,独立的分子大小和滞留量,但也提供结构信息,如静脉和RH。
能够准确地确定抗体的分子量和分子大小提供所需的人员和制造商信息是至关重要的,为了保持特定的应用程序所需的样品纯度和完整性。这种洞察力可以允许一个更深的理解,并最终控制,这些有价值的材料和他们的后续行为的最终用途疗法和其他有益的药物。
