液滴数字PCR (ddPCR)技术

液滴数字PCR技术是数字PCR方法利用油水乳化液滴系统。在油水乳液液滴形成形成单独的分区模板DNA分子。水滴服务基本相同的函数作为单独的试管或井在一盘PCR反应发生,尽管在一个小得多的格式。大规模样本ddPCR分区是一个关键的方面的技术。

液滴数字PCR系统分区核酸样品到成千上万的nanoliter-sized滴,每滴内进行PCR扩增。这种技术有一个较小的样本比其他商用数字PCR系统需求,降低成本,保护珍贵的样本。

样本分区是液滴数字PCR的关键。在传统PCR,单个样品只提供单一度量值,但在液滴数字PCR,样本划分为20000 nanoliter-sized滴。这种分区使成千上万的独立的测量放大事件在一个样本。

ddPCR技术使用微流体和专用表面活性剂化学PCR样本划分为油包水液滴(Hindson et al . 2011)。水滴支持PCR扩增的模板分子包含并使用试剂和工作流类似用于大多数标准TaqMan probe-based化验。PCR后,每个液滴分析或阅读的分数在原样品PCR阳性滴。然后将这些数据分析使用泊松统计确定目标DNA模板浓度在原始样本。

滴数字PCR超过之前的性能数字PCR技术,解决以往缺乏数字PCR可伸缩的和实用的技术实现。连续稀释是费力和介绍了吸量误差的可能性;竞争芯片系统依赖于复杂的流体分区方案。液滴数字PCR地址这些缺点通过大规模分区示例在流体相在一个步骤。创造成千上万的水滴意味着单个样本可以产生数以万计的数据点而不是一个结果,将固有的数字统计分析PCR的力量转化为实际应用。Bio-Rad滴数字PCR系统自动化ddPCR工作流的液滴生成,热循环,滴阅读,和数据分析,使这项技术可以研究实验室工作。

ddPCR数字PCR技术使高通量的方式使用较低的样本和试剂体积,降低总体成本与其他方法相比,同时保持灵敏度和精度数字PCR的特点。

ddPCR技术所带来的好处包括:

• 绝对量化——ddPCR技术提供了一个绝对计数目标DNA复制的每个输入样本不需要运行标准曲线,从而使该技术适合的测量目标DNA病毒载量分析和微生物量化
• 无与伦比的精度——提供的大规模样本分区ddPCR使小褶皱的可靠测量目标DNA序列拷贝数的差异样本
• 提高信噪比——高仿模板和背景被稀释,有效地丰富模板浓度target-positive分区,允许罕见的敏感检测目标,使量化的±10%的精度
• 去除PCR偏见——错误率降低去除qPCR的扩增效率的依赖,使检测的小(1.2倍)的差异
• 简化的量化(——校准标准和参考ΔΔCq方法)需要绝对量化
• 降低消耗成本pico - -反应卷只范围,减少试剂用量和每个数据点所需的样本数量
• 降低设备成本——emulsion-based反应系统意味着PCR反应可以在标准的热循环执行,没有复杂的芯片或微流体
• 优越的分区——ddPCR技术产量20000滴/ 20µl样本,近二百万分区PCR反应在96孔板,而芯片数字PCR系统只产生成百上千的分区。更多的分区收益率更高的精度

Bio-Rad的QX200滴数字PCR (ddPCR)系统包括两个仪器,QX200液滴发生器和QX200滴读者,加上相关软件和耗材。QX200液滴发生器分区(20µl到20000年nanoliter-sized滴)样品进行PCR扩增。使用热循环后放大,水滴从每个样本分析单独QX200滴读者,pcr阳性和PCR-negative滴数提供绝对量化目标DNA的数字形式。

ddPCR系统可用于:

• 发现罕见的DNA目标副本与无与伦比的敏感性
• 确定拷贝数变异与无与伦比的精度
• 用精致的精密测量基因表达水平

QX200滴数字PCR系统。QX200滴读者(左)和QX200液滴发生器(右)。

这个3 d动画视频描述的原则和过程使用Bio-Rad ddPCR滴数字PCR系统。

工作流非常简单。首先,QX200液滴发生器分区样本到成千上万的nanoliter-sized滴。PCR在热循环后,液滴流从每个样本在单一文件QX200滴读者数正面和负面的反应。pcr阳性和PCR-negative滴数提供绝对量化的数字形式。下面的步骤将更详细地描述。

步骤0:准备PCR-Ready样本开始ddPCR之前

步骤1:液滴的一代

滴一代之前,核酸(DNA或RNA)准备样品的任何实时分析:使用底漆,荧光探针(TaqMan探针与家人和十六进制或维克),专为液滴生成和专有supermix发达。样品然后放入QX200液滴发生器,利用专用试剂和微流体样品分割成20000 nanoliter-sized滴。创建的水滴QX200液滴发生器是统一的大小和体积。

步骤2:PCR扩增的液滴

滴都转移到96孔板在任何兼容的PCR扩增热循环仪。

步骤3:滴阅读

后PCR扩增核酸目标的水滴,样品都放在QX200滴读者,分析每个液滴单独使用一个双色探测系统(设置检测FAM和十六进制或维克),使多路复用分析不同的目标相同的样本。液滴的读者及其捆绑QuantaSoft™软件计算pcr阳性和PCR-negative滴。

数字阅读滴。荧光测量每个液滴在两个光通道是用来计算每个样本数量的积极和消极的水滴。

第四步:分析结果

积极的水滴,包含至少一份目标,表现出增强的荧光在消极的水滴。在ddPCR QuantaSoft软件措施水滴的数量为每个荧光团积极和消极的(例如,家人和十六进制)的样本。积极滴的分数然后安装在泊松分布来确定目标的绝对起始拷贝数输入反应混合物中的DNA分子在单位/µl副本。

样本结果ddPCR实验。样本标注在图中的每个液滴荧光强度与液滴数。一切积极滴(高于阈值强度红线所示)得分为正数,并且每个被分配一个值为1。所有负面的水滴(低于阈值)得分为负,和每个被分配的值为0(零)。这种计算技术提供了一个数字信号的计算起始目标DNA浓度的统计分析正面和负面的水滴的数量在一个给定的样本。

液滴从多路数字PCR数据实验,两个目标是PCR放大也可以看作一个二维图FAM荧光是策划与十六进制为每个液滴荧光。因为DNA分布成水滴遵循随机模式,水滴聚集成四组:

• FAM-negative, HEX-negative
• FAM-positive, HEX-negative
• FAM-negative, HEX-positive
• FAM-positive, HEX-positive

二维块液滴荧光。

QuantaSoft软件适合积极滴的分数泊松分布来确定单位的绝对起始拷贝数册/µl输入样本然后报告目标DNA浓度的形式复制每µl样本。

浓度的结果。样品浓度绘制每µl副本。

第五步:可视化数据

• Bizouarn Fhttp://www.genengnews.com/gen-articles/digital-pcr-improving-nucleic-acid-quantification/4093/
• Hindson BJ et al。(2011)。高通量微滴数字DNA拷贝数的绝对定量PCR系统。肛门化学83 (22):8604 - 8610。
• ibsen Pinheiro磅et al。(2012)。液滴的评估数字DNA拷贝数定量聚合酶链反应格式。肛门化学84年,1003 - 1011
• 第三代PCR (http://www.bioradiations.com/focus-on-technology/62-pcr/1329-third-generation-pcr)
• 液滴数字PCR在艾滋病研究打开了新的视角(http://www.bioradiations.com/focus-on-technology/783-ddpcr/1356-droplet-digital-pcr-opens-new-perspectives-in-hiv-research-)
• 一个简单的方法获取DNA分子的绝对量化使用创新的液滴数字PCR技术(http://www.bioradiations.com/focus-on-technology/783-ddpcr/1340-simpleddpcr)
• 一个新的范式进行精确定量的RNA (http://www.bioradiations.com/focus-on-technology/783-ddpcr/1333-ddpcr)
• 赛克斯PJ et al。(1992)。定量PCR目标的使用限制稀释。生物学技术13:444 - 449。PMID: 1389177