使用新的MicroCal PEAQ-ITC系统测量和表征protein-LMW化合物广泛的交互

绑定的测量和表征蛋白质和低分了体重(流明瓦)配体之间的相互作用是一个学术研究的焦点和药物发现。等温滴定量热法(ITC)直接绑定事件措施吸收或释放热量,为学习提供意味着protein-small分子相互作用在溶液中不需要标签或固定。重要的是,ITC通常是用来描述的差异及贡献向左反应配体结合小说。

的一个挑战与绑定交互的测量和表征是需要解决的范围广泛的亲和力。亲和力值(测量的离解平衡常数K_D)小化合物的绑定到目标蛋白在一个典型的药物发现项目可以从低毫克分子subnanomolar跨度范围。依赖于生化系统研究(受体,酶,等等),一个同样广泛的关联范围相关的学术研究。

高度敏感的ITC仪器和正确地设计实验大大简化绑定交互的描述。我们新的ITC系统,MicroCal PEAQ-ITC,旨在改善信号稳定、混合、和信噪比特性(图1)。这些变化,以及一个高级实验设计功能集成在易于使用的数据分析软件,便于优化的实验研究的挑战性的交互。本白皮书强调了有益的特性的新MicroCal PEAQ-ITC仪器和软件绑定交互通过直接和竞争分析的滴定。

MicroCal PEAQ-ITC仪器通过改进数据质量

乙酰唑胺滴定的牛碳酸酐酶II进行比较新的MicroCal PEAQ-ITC,与其前任MicroCal iTC200。两组实验的数据表明,MicroCal PEAQ-ITC大约有5次短期低噪音(图1)。这些改进数据质量增加信心挑战分析数据时较低的加热样品是宝贵的或低浓度时必须准确地量化low-nanomolar亲和相互作用。

图1:原始ITC数据的叠加滴定20µM乙酰唑胺(ACZA) 2µM牛碳酸酐酶II (bCAII)使用MicroCal PEAQ-ITC(上)和MicroCal iTC200(底部)系统。

广泛的结合亲和力

这里展示的适用性PEAQ MicroCal ITC仪器表征绑定交互进行滴定的牛碳酸酐酶II (bCAII)和人类碳酸酐酶(hCAI)的抑制剂。这些例子涵盖广泛的K_D(0。320毫米~ 1 nM)和焓变(~ 6 ~ -15千卡/摩尔)。典型的数据集如图2所示,结果总结在表1所示。

图2:原料(上)和综合热(底部)情节200年滴定的µM呋喃苯胺酸到20µM bCAII(左)使用2µL注射和25µM ethoxzolamide到2.5µM bCAII使用1µL注射(右)。

表1。总结结果滴定(n = 3)的卫生保健相关感染和bCAII一系列抑制剂。配体被滴定到目标蛋白质浓度如下:2.5毫米35µM hCAI磺胺,200µM呋喃苯胺酸到20µM bCAII, 50µM乙酰唑胺成5µM bCAII, 50µM ethoxzolamide 5µM卫生保健相关感染和25µM ethoxzolamide到2.5µM bCAII。实验在PBS缓冲,2%在25°C v / v。

蛋白质	化合物,n = 3	N(网站)	错误(N), %	KD(M)	pKD	错误(KD),%	ΔH(千卡/摩尔)	错误(ΔH), %
卫生保健相关感染	Sulfanil - 酰胺	1.0	固定	3.2 e-04	3.5	16	-5.9	15
	Ethoxzol - 酰胺	1.0	1.0	1.9 e-08	7.7	7	-8.7	1
bCAII	呋喃苯胺酸	1.0	1.7	3.6 e-07	6.4	18	-6.3	3
	Acetazol - 酰胺	0.9	0.6	1.8 e-08	7.7	3	-12.6	3
	Ethoxzol - 酰胺	0.9	0.3	4.4平台以及	9.4	95年	-14.4	3
	Ethoxzol - 酰胺Vinj = 1 uL	1.0	1.0	1.3 e-09	8.8	76年	-15.1	1

所有的相互作用进行了研究使用标准协议的注射18日2µL整除的配体进入细胞中蛋白质的解决方案。与亲和力的18海里和弱,错误的K_D都不到20%,远低于10%。焓和化学计量数据的错误也都在3%以下,除了磺胺:卫生保健相关感染交互的N固定和焓变变化的15%。这些测量显示的高度可再生的数据可以通过使用这台仪器即使蛋白质浓度低至2.5微摩尔的。

可以预见的是,ethoxzolamide,紧凑的粘合剂,显示最高的K变化_D值(表1)一式三份实验由于相对较高的值*和定义良好的过渡范围由只有两个实验数据点绑定等温线。即便如此,94%的错误通常是可接受的对这些紧密的交互和数据提供一定的信心。

然而,由于信号噪声和良好的精度低的的吸管MicroCal PEAQ-ITC仪器(图1),小,1µl注入卷可以使用。使用这种方法可以填充过渡区(图2)有更多的数据点增加关联数据的质量。这是证明了在小但可测量的误差下降K_D进一步增加76%的信心数据。图3显示了这些数据的pK_D这可能是更合适的方法来比较关联数据。

*值被定义为C = N *(细胞)/ KD,[电池]摩尔浓度的高分子细胞,KD是平衡离解常数,N表示高分子结合位点的数量。

图3:K的摘要_D值获得新的MicroCal PEAQ-ITC仪器和分析软件的一系列流明瓦抑制剂卫生保健相关感染(红色)和bCAII(蓝色)。所有的数据收集与18×2µl注射的配体蛋白质。此外,K_D在滴定值获得38×1µl注射(第一次注射0.4µl)也报道与ethoxzolamide bCAII互动(EZA)。为了便于比较,K_D值在图表示为pK_D。误差线显示错误单位pK_D(错误% K_D表1中给出),缩写:EZA -ethoxzolamide, FUR-furosemide, ACZA-acetazolamide, SULFA-sulfanilamide, bCAII牛碳酸酐酶II和卫生保健相关感染——人类碳酸酐酶。

竞争滴定技术量化中low-nanomolar绑定

从数据已经很明显这个白皮书所示错误K_D决心增加亲和力变得更严格。在这种情况下竞争可以使用滴定法。

在竞争实验中,强烈的结合配体注入靶蛋白在存在弱,竞争力的化合物。在缺乏较弱的抑制剂ITC滴定没有足够数量的数据点拟合所需的过渡区,一个独特的绑定等温线。这方面的一个例子如图4所示,在200年µM ethoxzolamide注入20µM bCAII 2µL整除。通过使用竞争实验设计工具提供MicroCal PEAQ-ITC(见图5),可以确定实验条件,确保足够数量的数据点在过渡范围和足够高的热量值好信号噪声。一组100µM呋喃苯胺酸添加到蛋白质的解决方案被选中。结果滴定如图4所示。

图4:生(A)和集成ITC数据直接滴定200µM EZA到20µM bCAII和(B)竞争滴定200µM EZA到20µM bCAII和100µM毛皮。

图5:实验设计工具的竞争MicroCal PEAQ-ITC

表2:绑定参数bCA二世与EZA获得直接滴定25µM EZA到2.5µM bCA二世和200年竞争滴定µM EZA到20µM bCA二世与100年预拌µM皮毛,Vinj = 2µL。

实验装置	KD(nM)	错误(KD),%	ΔH(千卡每摩尔)	错误(DH), %
直接滴定法	0.4	95年	-14.4	3
竞争滴定	0.4	40	-13.9	6

紧密绑定的绑定参数来源于竞争从直接滴定法滴定很同意数据(表2)。这个案例研究演示了竞争的效用实验,测定紧密绑定交互的设计工具。

摘要和结论

这里的结果显示的质量数据,可以实现与新Microcal PEAQ-ITC系统。它有一个高的信噪比,可以用来测量范围广泛的亲和力。最紧凑的例子来衡量,即EZA之间的交互和bCAII 1海里只有双重可变性的亲和力。这是任何技术卓越的可重复性测量摩尔相似。这里的微摩尔的交互测量的错误只有大约20%或更好。这些代表优秀的可重复性K的决心_D。

竞争实验,蛋白质与配位滴定和另一个预先混合,可用于扩展的关联范围ITC可以用于高picomolar范围。这种方法的一个缺点是实验设计的复杂性。的MicroCal PEAQ-ITC分析软件仿真工具进行设计和分析很简单。

除了信噪比的改善,MicroCal PEAQ-ITC系统完全自动化的数据分析,减少分析时间和用户主观评估数据质量。确定数据质量和安装在几秒钟执行实验允许分析50或更多的大型数据集实验在几秒钟内。