10个免疫组化染色定量提示

科学界正投入巨大的努力来开发日益复杂的在体外分析，以促进高分辨率成像。虽然这是可能的在活的有机体内他们需要高度专业化的培训和昂贵的设备。

在体外高分辨率成像使得直接观察不同细胞类型在疾病发作或药物反应中的作用成为可能。这正成为一种特别强大的工具，因为研究已经表明，细胞微环境可以极大地影响癌症等疾病的发展¹，以及化疗等治疗方法的成功。²

通常，强大的表型信息可以从细胞图像中提取。此外，人们可能想要获得基因型数据来关联表型和基因型。因此，免疫组化(IHC)通常是首选的工具。

免疫组化包括用荧光抗体染色固定细胞，以检测特定生物标志物的存在。注意，IHC使用固定细胞，因此仅限于研究固定时间点的样本。另外，人们可以使用活性荧光染色，这可能是强大的，但与此同时，染色可以以未知的方式影响细胞的活力和行为。

尽管免疫组化非常强大，但如何从生成的图像中提取信息通常也不清楚。

在这里，我们揭示了10个技巧，可以帮助你设计一个策略来分析你的IHC图像。

这些一般提示旨在帮助您设计分析，并可应用于您选择的图像分析软件。

垃圾进，垃圾出

对于图像后期处理，你能做的只有这么多。

如果图像的质量很差，或者实验设计没有做好充分的准备，分析就不可避免地会有缺陷。

第一个建议是对你选择的图像进行高度选择性的分析，因为你可能会浪费大量的时间来优化分析，这是注定的，因为图像的质量很差。

不要等待从大量的实验中获取图像来完善你的分析

一旦您从第一组实验中获得了免疫组化图像，请查看它们，以便您可以快速识别染色的任何潜在问题，并确认您当前的免疫组化方案使您能够回答感兴趣的问题。

这确保您可以在下一组实验之前快速调整您的方案，并最大限度地减少浪费时间和精力在样品染色不充分上的风险。

质量控制至关重要

在免疫组化中，你不能绝对地回答你的问题。

换句话说，在实验过程中，染色可能受到许多因素的影响，这些因素是程序或操作者固有的。这意味着用免疫组化正确回答科学问题的唯一方法是将您的结果与经过相同过程的对照样本进行比较。

你还需要使用控件来证明你的污渍确实有效。例如，你需要对你的第一和第二抗体使用同型控制，以检查信号不是由抗体和细胞之间的非特异性相互作用引起的。阴性和阳性对照对于验证染色的特异性是必要的。

具体来说，你应该使用你知道不表达感兴趣的生物标志物的细胞，并证明你的生物标志物没有在这些阴性对照中被检测到。

另一方面，你也应该染色你知道应该表达标记的细胞，并证明你可以在阳性对照中看到生物标记。

免疫组化可以帮助你检测生物标志物的存在

确定你的样本中是否表达了感兴趣的生物标志物是一个可以用免疫组化来回答的基本问题。

如果您能检测到与您在免疫组化方案中使用的荧光标记相对应的颜色像素，则称为“表达”生物标记。

例如，如果使用488 nm的偶联抗体，绿色像素的存在将显示生物标志物的表达位置。不用说，你要确保你的样本中没有其他东西是绿色的，否则你就无法区分特定于你的生物标志物的信号。

值得注意的是，你经常可以发现背景荧光不是特定于你的生物标志物——这可以在你的阴性对照样本上量化，这些样本不应该表达任何生物标志物。

你需要决定它是否小到你可以忽略它，或者它是否重要到你应该把背景荧光减去你的信号，或者决定一个阈值，在这个阈值以下你认为你的荧光是非特异性的。

确保信噪比很小，否则你可能只是在观察噪音!

在条件A和条件B之间，标记物的数量有变化吗?

一旦您知道您的标记在您的示例中得到了表达，您就可以开始研究它在不同条件下的相对表达。

在这种情况下，你有几个选择:你可以比较样品之间的染色强度或染色程度。

换句话说，比较信号的直方图，看看是否:

• 有更多的像素表示任意数量的标记，或者:
• 一个更高的信号强度正在被表达，这是相同数量的像素具有更高的强度。

这两种变化都可能表明你的生物标志物在整个样本中的表达更高。

是否有更多的细胞表达生物标志物?

到目前为止，我们已经讨论了分析整个图像的像素。然而，更有意义的信息可以通过研究单个细胞来提取。

如果你在整个图像中看到信号的全局变化，这是否意味着更多的细胞表达了生物标志物，还是相同数量的细胞表达了更多的生物标志物?

要回答这些问题，请分割单元格的边缘，以便您可以单独考虑它们。

一旦完成，你就可以量化有多少细胞包含感兴趣的颜色像素:与信号重叠的细胞可以被认为是表达生物标志物的细胞。

同样，决定一个背景阈值是非常重要的，在这个阈值之下，你认为信号只是噪声，使用负控制。

您将看到，将信号共定位到细胞可能比在图像中对整个细胞群平均信号更有信息，因为细胞可能非常异质。

每个细胞是否表达了更多的生物标志物?

为了解决细胞异质性，您还可以量化每个细胞的信号强度，而不仅仅是它的存在。这不同于回答是否更多的细胞表达生物标志物:这是测试细胞是否表达更多或更少的信号。

同样，您需要分割细胞并量化每个细胞信号的总强度。这可以揭示样本中特定细胞的重要信息，这些细胞对环境变化敏感，而其他细胞可能不敏感。

它在细胞的什么地方表达?

你可能还想确定生物标记物在细胞内的位置。例如，一些细胞内蛋白质可以从细胞核转移到细胞的细胞质中。

为此，将感兴趣的生物标记物与细胞核共定位染色，细胞核可以用DAPI染色。

通过量化细胞核染色和生物标记染色之间重叠百分比的变化，您可以测试感兴趣的蛋白质是否改变了其细胞内定位，从细胞核进入细胞质。

建立生物标志物分布

表面受体对许多生物过程至关重要，通常用免疫组化染色。除了检测它们的存在，还可以观察细胞膜周围的染色分布，并观察在某些情况下是否会发生变化。

要做到这一点，你可以计算细胞周围的强度分布，并观察受体的分布是否在不同条件下发生变化。这可能与参与细胞间紧密连接的表面受体特别相关。

与微环境的关系

分析不同的颜色可以提高你的分析能力。例如，荧光标记的细胞可以以不同于感兴趣的生物标记物的颜色显示。

这使得研究特定细胞类型和感兴趣的生物标志物之间的空间关系成为可能。

你可以确定不同细胞类型之间的物理接触或接近是否会改变给定细胞中生物标志物的表达。这为研究微环境对给定生物标志物表达的影响打开了大门，这可能是相当强大和相关的，特别是在复合物发展的背景下在体外包含多种细胞类型的模型。

参考文献

1. 乔伊斯，J. a &波拉德，J. W.微环境调控转移。Nat. Rev. Cancer9, 239-52(2009)。
2. 休斯，R.等。血管周围M2巨噬细胞刺激化疗后肿瘤复发癌症Res．(2015)。doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 14 - 3587