成功开发细胞培养测定的10个技巧

细胞培养最早是在20世纪初发展起来的。^1、2它的开发是为了在简单的研究中可视化和研究细胞，与体内存在的大量其他细胞和生化因素隔离开来。它现在在生物医学实验室中无处不在，并正在迅速发展以满足日益增长的制药需求。传统上，细胞培养已被用于生产生物疗法，如抗体。^3.现在，细胞培养也已成为再生医学的关键程序⁴还有药物研发。⁵简单地说，在培养皿中培养细胞要么是为了替代患者体内受损的细胞，要么是为了重建模拟患者器官的细胞模型，以测试药物的疗效和安全性。虽然技术进步正在重塑细胞培养领域，但许多基本步骤至今仍在实验室中手工完成。这意味着这些协议还远远没有标准化，而且经常容易出现可变性和人为错误。在这里，我们提供了我们认为必不可少的检测技巧，专为任何开始细胞培养的人设计，可以与这些补充3D细胞分析技巧．

原代细胞还是永生细胞?

细胞来源的选择是至关重要的:它决定了细胞模型的生理相关性。科学家可以在原代细胞或永生细胞(也称为细胞系)之间做出选择。永生化细胞持续分裂是由于突变导致它们逃避正常的细胞衰老。相比之下，原代细胞的扩张能力有限，因此只能传代一定次数，从而限制了人们可以获得的细胞数量。使用原代细胞可能更加昂贵和麻烦，因为你需要获得动物或人体组织，或者从供应商那里反复获得它们。然而，它们更具有生理相关性，因为它们直接从组织中提取，经历了较少的种群加倍，并且代表了独特的供体。

细胞系是非常实用的，因为你可以多次传代它们，而且有许多具有良好特征的细胞系可用。然而，由于它们来自同一个原始供体，它们在基因上更加同质。请注意，同质性有时可以最小化噪声，从而有助于获得统计上显著的结果。

最后，尽管这需要专门的知识，但也可以在分离后使细胞永生⁶从病人或动物身上。在目前的个性化医疗竞赛中，人们可以说原代细胞具有优势，但要仔细考虑是否有适当的预算和设施!

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机械技术

即使在今天，你也会惊讶于这在生物医学领域是一个多么大的问题。多达3万项研究发现使用了“错误的”细胞系。⁷在第一次获得你的细胞时，试着仔细检查它们是否是你想要的。例如，你可以给它们染色，作为它们已知表达的标记。在那之后，确保你没有用任何其他类型的细胞污染它们，并非常小心你的标签!

仔细准备你的细胞储备

细胞储备由许多小瓶组成，这些小瓶中充满了来自相同原始样品的细胞，这些细胞一起膨胀并传递了相似的次数。小心不要在准备细胞液时犯任何错误，因为所有后续实验都会受到影响!例如，确保你贴上适当的标签与细胞的名称，他们的通道号和细胞库存的日期。此外，确保不要用其他类型的细胞或细菌污染你的细胞储备:换句话说，小心处理你的细胞储备，以确保它可以用于所有后续的实验。

为了制作原液，通常将细胞重悬在含有高达10%二甲基亚砜(DMSO)的细胞培养基溶液中，以防止在冷冻过程中形成冰晶。你也可以添加不同浓度的血清，以最大限度地恢复你的细胞。然而，DMSO可能对细胞有毒，所以确保一旦你的细胞重新悬浮在含有DMSO的溶液中，你要迅速将小瓶转移到-80°C的冰箱中。这意味着你应该在这一步之前标记好你的瓶子，这样它们就可以被填充了。一个小而重要的细节:使用市售的标签，可以承受极端的寒冷，否则他们可能无法保持附着在试管长期存储!理想情况下，首先将小瓶放在冷冻箱中，这样可以优化转移到-80°C冰箱的冷却速度。在那之后，确保第二天将你的小瓶转移到液氮中，以确保你的细胞的活力。

始终使用相同的储存单元

当你储备细胞时，一定要准备足够的小瓶来完成你的整套实验。由于许多用户或环境依赖因素，细胞储存库之间往往存在很大的变异性，甚至由于遗传漂变，不同传代之间也存在很大的变异性。因此，使用一个单元料可以最大限度地减少结果中的噪声。然而，将你的实验推广到其他批次的细胞或细胞类型总是明智的!

轻轻地解冻你的细胞!

解冻细胞是一个进退两难的问题:你不能解冻得太快，否则对细胞的温度冲击会太残酷，但同时你也不能太慢，因为冷冻溶液中的DMSO会损害你的细胞。

不要解冻你的小瓶太长时间，并逐步加入，迅速，新的温暖的介质到你的细胞中和DMSO!

一些方案建议立即离心，用没有DMSO的新鲜新培养基培养细胞。其他人建议跳过对细胞有害的离心，直接将细胞置于烧瓶中，同时通过添加大量新鲜介质来稀释DMSO含量。这两种方法都不是完美的，你的选择很可能会随着你处理的细胞类型而变化。检查供应商的协议，看看他们推荐什么。

尽量减少胰蛋白酶的暴露

一般来说，细胞紧紧地附着在表面培养物上，必须使用诸如胰蛋白酶之类的化学试剂将其分离。然而，这些试剂可能对细胞有毒。尽量减少胰蛋白酶的接触，一旦细胞被分离，用比胰蛋白酶大得多的培养基迅速中和胰蛋白酶。

涂层表面

通常，细胞培养的表面被细胞外基质蛋白覆盖，以改善细胞的生长和存活⁸或分化。⁹例如，I型胶原蛋白可以沉积在烧瓶上，通过在烧瓶中填充一层胶原蛋白溶液至少几个小时来促进细胞增殖。在培养细胞之前，请务必用水清洗涂层溶液，因为溶液中的某些成分直接接触可能对细胞有害。

优化你要使用的媒体

媒体解决方案通常就像黑盒子。它们是由基础溶液，补充生长因子和血清。如果你对它们的内源性分泌感兴趣，添加的生长因子可能会掩盖你的结果。此外，不同批次的培养基可能存在很大差异，因为它们通常含有从动物身上分离出来的血清(例如胎牛血清)。¹⁰因此，在可能的情况下，使用相同批次的介质进行实验。如果可以，就去无血清:研究人员已经证明，转基因内皮细胞可以在没有血清的情况下存活。¹¹

控制单元格的融合度

合流度是衡量细胞培养面积的指标。烧瓶里的细胞越多，它们就越融合。一些细胞，增加合拢后，可以有改变的形态，增殖，基因表达和活力。^12、13许多实验程序要求60-90%的融合度，以确保细胞活力和成功。因此，通过定期在显微镜下检查，确保不要让你生长的细胞变得过于融合。如果你还没有准备好你的实验，当你的细胞已经融合，只是传代你的细胞，并保持在一个新的烧瓶(所谓的传代培养)。注意，细胞的原始密度也很重要:如果在烧瓶中放置的细胞数量过低，它们可能不会生长，或者会生长但非常缓慢。这意味着在传代培养时不应过度稀释细胞。但是记住要前后一致．对于一组给定的实验，总是让你的细胞传递相同的次数。

检查污染

细胞在体外培养过程中容易受到化学或生物污染的污染。虽然这本身就是一个庞大而复杂的课题，¹⁴有些污染物比其他污染物更容易检测。例如，你可以在显微镜下检查培养物中移动细菌的存在(不要与漂浮的细胞碎片混淆!)然而，支原体检测必须使用市售试剂盒。在任何情况下，确保使用无菌技术将污染的可能性降到最低!

由:

参考文献

1. 活生生的发育中的神经纤维的观察。Proc, Soc。实验医学杂志。地中海．4， 140-143(1906)。
2. Carrel A和Burrows MT.体外成人组织和器官的培养。j。医学协会。．55， 1379-1331(1910)。
3. 李芳，沈怡娟，李文敏，李文敏。单克隆抗体制备的细胞培养过程。马伯2， 466-479(2010)。
4. Wendt, D.， Riboldi, s.a.， Cioffi, M. & Martin, I.生物反应器在3D细胞培养和组织制造中的潜力和瓶颈。放置板牙．21， 3352-3367(2009)。
5. 方勇和埃格伦。M.三维细胞培养在药物发现和开发中的应用。sla。生命科学R D22， 456-472(2017)。
6. 罗宾，j.d.。等．从肌肉活检中分离和永生化患者来源的细胞系用于疾病建模。J. Vis. Exp．(2015)。doi: 10.3791/52307
7. 霍巴赫，S. P. J. M.和哈尔夫曼，W.海拉的幽灵:细胞系错误鉴定如何污染科学文献。《公共科学图书馆•综合》12， 1-16(2017)。
8. Somaiah C。等．胶原蛋白促进间充质干细胞的高粘附、存活和增殖。公共科学图书馆在e10， e0145068(2015)。
9. 妈,W。等．细胞-细胞外基质相互作用调节人胚胎干细胞的神经分化。BMC发展生物学．8， 90(2008)。
10. 减少细胞培养的可变性。生物学技术43， 228-9(2007)。
11. Seandel, M。等．通过腺病毒E4ORF1基因产生功能持久的血管生态位。Proc。国家的。学会科学．105， 19288-19293(2008)。
12. 王，L. & Adamo, M. L.细胞密度影响胰岛素样生长因子I基因表达在细胞类型特异性的方式。内分泌学141， 2481-9(2000)。
13. 金，D. S。等．细胞培养密度影响脂肪组织来源间充质干细胞干性基因表达。生物医学。报告6， 300-306(2017)。
14. 理解和管理细胞培养污染-康宁技术简报。