6建议改善样品染色流式细胞术

流式细胞术是一个细胞技术,利用激光和荧光(在大多数情况下)来研究细胞的基因表达谱和功能。流式细胞术的力量是能够收集数据以高速度(每秒30000细胞)和多参数(通常15或16但延长到40 +一个样本)。最初在免疫学领域的开发,流式细胞术现在已经应用在生物科学和超越。一个成功的流式细胞仪实验始于良好的样品制备。

1。样品的来源

流式细胞仪测量单个细胞的特点,通过一系列的激光一次。这需要在单个细胞悬液样本。如果我们正在研究细胞从血液或灌流液然后生成单个细胞悬液是相对简单的细胞天生不是物理上连接到另一个。然而,生物学家通常感兴趣的细胞与组织,这使得生成单个细胞悬液更大的挑战。

组织是一个集合不同的细胞在一个复杂的紧密联系在一起。我们需要区分这个复杂而维持细胞生存能力、生理稳态和抗原完整能够执行精确的流量仪分析。脾脏等组织,例如,相对比较柔软,很容易按到100µm网一个注射器柱塞或类似。因为这涉及到没有维护和抗原酶行动细胞生存能力不受影响。

然而大部分的组织更加具有挑战性!在这些情况下,需要更多的肌肉细胞和酶分解,温度和机械技术是常用的,经常在一起,产生单个细胞。这些方法可能非常有害细胞,导致广泛的抗原细胞死亡和损失。

协议执行组织消化网上大量的来源。然而,一个高度全面指导一切组织消化卫氏生化公司网站上可以找到。¹首次指导,这是一个很好的资源之间各种各样的组织从一长串的生物体。

消化组织遵循协议的一般方法,包括机械的装腔作势的组织,酶消化,最后过滤紧随其后。

要理解协议,我们需要考虑每一步的潜在陷阱。

2。机械技术

删除从生物组织后,解剖了尽可能多的多余的脂肪和组织改进的其他协议的有效性。机械技术,如切碎用手术刀或用剪刀切之后,叶面喷洒和过滤用于粗打破组织,增加表面积的酶。是很重要的机械破坏在缓冲介质适用于酶的存在阶段的协议。例如,酶可能需要二价阳离子的功能,在这种情况下你应该避免螯合剂EDTA等。如果使用胰蛋白酶,您应该使用一个平衡盐溶液,不包含镁和钙。最合适的缓冲的方向应该是提供的产品。如果没有,合适的缓冲信息可以发现有一个小的研究。

3所示。酶消化和孵化温度

讨论了这两种技术在一起因为酶是活跃在生理温度,这是细胞通常是最活跃的。因此一个潜在的潜伏期增加样本死亡细胞的生理环境和压力可能会导致异常的信号或生理的变化(受体内化或激活)。通常,我是用来消化组织胶原酶类型,但可以使用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等酶。这三个例子的蛋白水解酶裂解蛋白在特定序列。小心,如果乳沟序列存在于你的目标抗原,它也将因此缺席下游分析分开。

从生理方面,重要的是,孵化温度和时间进行了优化,使酶来完成他们的“东西”示例没有不良影响。很难说多长时间样本应该获得最佳消化孵化,通常1或2小时37°C是充分的。孵化应该允许足够的时间组织消化但不久,细胞死亡增加——这将取决于组织的类型。密切关注过程和停止消化一旦你的示例将出现均匀,在消化从来都不是一个好主意。请注意,潜伏期可达18个小时对于某些类型的胶原酶是必要的。

优化培养时间和温度通常是一个经验的过程,需要仔细平衡和一个元素的试验和错误。细胞退化可能减少降低孵化温度但因此这可能降低酶活性。培养时间将需要增加可能会再次增加细胞退化。

胰蛋白酶是一个强有力的组织分解酶和可能导致损失的样本如果孵化太久在37°C。用胰蛋白酶建议您在4°C,使执行一夜孵化酶穿透组织。样品应该培养30分钟37°C第二天将它分解。

一个词在酶和考虑什么。酶是生物制剂,因此将包含活动的变化。酶可以不同制造商的质量对于他们有多纯洁。酶也可以从很多很多,可以令人沮丧在处理他们在很长一段时间。当采购你的酶确保你得到足够的进行优化和尽可能多的实验你能想象你需要!另外,联系制造商尽可能多的适应在持有股票的具体要求。

消化步骤我们淬火后的酶的活性增加平衡盐溶液(例如汉克斯平衡盐溶液)与大约2%血清(如胎牛血清、(的边后卫))的示例。你应该在这一点上有一个松散的组织准备,可以分为单个细胞通过温和的混合1毫升或10毫升吸管(取决于你的体积)。

恢复细胞从最初的悬挂在约300 - 400 x g离心5分钟(阻碍)消除了残余酶的细胞。resuspending合成颗粒后平衡盐溶液样品通过一个合适的滤波器(我们经常使用100嗯过滤器)从样本中删除任何最终聚集和执行细胞计数/可行性评估(见下文)。理想情况下消化后会执行所有步骤在冰或降低温度与冷冻缓冲区和低温离心机,避免任何进一步的细胞活性,减少细胞死亡。

4所示。死细胞

死细胞可以在分析和一个真正的问题可能是一个主要问题时好与抗体染色流式细胞术。

死细胞容易结合抗体生成artifactual流感数据和假阳性染色。的死亡,他们也在这个过程中,释放大量的DNA进入文化——给样本认为“下贱的外表——能导致细胞粘在一起,进而死亡。如果发生这种情况,解放的DNA可以删除容易使用DNase可以添加到许多组织制备缓冲。

消化后的协议是一个好主意来检查细胞生存能力。这可以用许多快速而简单的方法。传统锥虫蓝轻轻混合是一个整除的细胞样本应用程序之前,血细胞计数器(计数室幻灯片)和作为一个微分染色评估样本的可行性。在光学显微镜下观察台盼蓝了死细胞具有强烈的蓝色和蓝色弹珠允许计数(生活)和蓝色(死)细胞。最近基于荧光高效系统可用的生活和死细胞已经成为歧视雇佣一个建在显微镜和相机的计算和评估可行性。如吖啶橙染色用于标签的所有细胞和propidium碘或DAPI坏死细胞可用于染色的。使用一个相机和软件使比血细胞计数器计数健壮且更简单。

如果死细胞是一个主要的问题在你的样品,有商用浓缩包可用于“清理”示例以类似的方式使用珠子基于抗体的分类。这些包好,显著改善样品染色,通过最小化不良死细胞减少采购时间和文件大小。

许多公司现在可以解决的可行性试剂销售。历史上如果你想确保你没有看死细胞分析您将添加一个死细胞鉴别器如propidium碘或7法。然而这些试剂样品只有在生活——在漫长的一天分离细胞和染色样品你想要做的最后一件事是在午夜运行样本!可确定的可行性试剂是伟大的,因为他们可以使用之前染色,然后固定。样品可以在一夜之间被存储和运行第二天可能会有更多的时间可以在机器和你有更多的能量!能够解决样品也使他们更安全处理从生物安全的角度。

5。红细胞和碎片

红细胞(红血球)丰富在许多生物系统和可以从的角度有问题的样本采集。红血球数量non-RBCs ~大展身手的比率在大多数样品类型,并且可以掩盖我们会感兴趣的事件。他们可以用一个相对简单的去除渗透溶解步骤,但要注意,一些裂解缓冲可以有害non-RBCs和可能导致损失的细胞类型,如肥大细胞或嗜碱性粒细胞。

产生的碎片,将组织和坏死细胞分解的样品准备期间,也可以是一个问题在分析组织。红血球以类似的方式,大量的碎片可以识别细胞的一个挑战。碎片是一个更加难以消除,但可以通过密度梯度离心法或使用排序技术,如浓缩珠子。

6。从你的流式细胞分析仪获得最好的

流式细胞术的一个重要方面常常忽略的样品制备,是优化的染色条件。重要的是要使用正确的抗体的样本数量。执行滴定你所有的抗体,这可能看起来像一个昂贵的运动但最终可能省钱当你可能需要抗体低于制造商建议的每个测试。通常公司验证抗体样本可能给最好的结果——这通常是外周血单核细胞(PBMC)样本。这并不意味着这是您感兴趣的组织的最佳浓度。

你的细胞计数。细胞被染色的数量对染色的质量产生重大影响。在可能的情况下确保你总是标签相同数量的细胞——这并不总是那么容易。如果你正在与小活检或体液细胞的数量可能显著不同,在这种情况下这是一个情况下的优化可能最多的细胞样品中你所期望的。

总之,最好的方法来改善样品染色流式细胞术是确保你有一个健康的,单个细胞悬液,最低级别的死细胞和红细胞表面是免费的从尽可能和碎片。使用一个可行性试剂,这样您就可以确定死亡细胞样本和删除它们从分析管道从非特异性抗体绑定和总量减少文物。最后,花时间去执行你的试剂滴定组数量的细胞,这将节省你的时间和金钱从长远来看,提高质量,并允许您生成的数据的标准化。

引用

1。沃辛顿生化公司网站http://www.worthington-biochem.com