6建议最佳的转染

如何引导

发表:2018年3月28日

| Tae Yeon柳

转染是一个重要的细胞生物学技术,引入核酸(DNA和RNA)真核细胞。这是特别有用,当一个人想表达基因工程蛋白质在细胞(通常通过质粒DNA转染)或耗尽内源性蛋白小干扰rna转染(通过)。

一般来说,三种转染方法普遍使用:化学转染,电穿孔(或nucleofection),和lenti /逆转录病毒转染。前两个方法视为“瞬时转染”,因为引入了核酸在细胞的数量随着时间的推移,由于减少退化和稀释。另一方面,病毒转染DNA合并到一个内生的染色体,复制在细胞周期,因此被认为是“稳定转染”。在本指南中,我将只关注瞬时转染方法在我的经验这是棘手比病毒转染。

有许多商业套件化学转染和电穿孔。你是否遵循协议从制造商或一篇论文,你就会发现很难得到一个令人满意的结果没有优化协议来满足您的需求。下面列出我认为什么是最有用的建议成功转染,学会通过多年的经验和故障排除转染实验。

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化学转染对电穿孔

有很多化学转染的优势。首先,它不需要设备和比色皿。考虑到一个非常基本的电穿孔设备是大约10000美元,这可能是一个巨大的优势。其次,有更大的灵活性转染所需细胞的数量。使用电穿孔,细胞的数量在很大程度上是依赖于小池的大小。

在这种情况下,为什么要使用电穿孔?首先,电穿孔作用对某些难转染的细胞类型(例如,一些主要细胞株)化学转染。其次,在我看来,一个很简单的协议,你可以进行电穿孔时分裂细胞培养。

一些额外的小贴士:

大多数商业化学转染工具包是为小干扰rna转染DNA转染或设计的,但是我看到很多人说,任何装备都可以用于应用程序。
大多数公司提供免费的样品,您可以使用它来试用。
电穿孔设备还可以用于提供其他membrane-impermeable分子进入细胞(例如Alexa染料)。

做优化

首先,尝试制造商的协议。一些细胞类型特异的协议还制造商提供,所以检查他们的网站。如果你看到毁灭性的细胞死亡(经常发生)或转染效率很低,那么您应该优化。如果你正在做化学转染DNA量不同,DNA-to-reagent比率,transfection-to-assay时间、血清和抗生素的存在在你的成长媒体(除非协议说,它真的不重要)。在我看来,最重要的因素是DNA和试剂的数量。我总是得到更好的结果,当我使用DNA和试剂比建议的制造商的协议。如果您使用的是电穿孔,你可以尝试不同数量的DNA,电压和脉冲持续时间。

做验证

您可以使用rt - pcr、免疫印迹、流式细胞仪或成像评价转染效率。我最喜欢的验证方法是用GFP转染质粒或荧光控制核和量化细胞显示荧光信号的分数通过使用一个简单的荧光显微镜10倍的目标。

使用高质量的DNA

质粒提取大肠杆菌文化可以通过内毒素污染,不利于细胞转染实验的可行性。我强烈推荐使用midi -或maxi-scale DNA提取试剂盒(而不是miniprep),包括更广泛的洗涤步骤和乙醇沉淀步骤。

使用健康的细胞。细胞的生存能力和健康也影响转染效率的重要因素和post-transfection细胞的可行性。

限制通道数;我通常不保持细胞培养2个月以上。
给细胞足够的时间从压力中恢复过来。解冻后的新瓶冰冻的股票,我建议使细胞前几次使用。我也保证分裂后的细胞至少有一夜之间长大之前用于化学转染。
小心谨慎的污染,特别是如果你不使用任何抗生素在你生长的媒体,因为它影响转染效率。定期做支原体测试(很简单的执行),如果你得到一个积极的测试,或看到小物体(几微米)漂浮在显微镜下,不要犹豫地扔掉你的文化和解冻新瓶冰冻的股票,和替换你的媒体,PBS和胰蛋白酶。
不要让你的细胞培养成为over-confluent。通过细胞到达~ 90% confluency之前。