7提示成功发展的三维细胞培养检测

细胞的研究传统,将细胞2 d表面。虽然这些研究非常有用在推进生物医学研究,现在接受的是,2 d细胞无法忠实地代表许多关键细胞生物体的生理特性。毫不奇怪,这主要是因为细胞在活组织的发展在三维空间!

在3 d细胞被迫互动更多地通过他们的整个表面区域的微环境,与其他细胞或细胞外基质(ECM)。相比之下,细胞培养2 d通常有玻璃或塑料接触面积的一半,另一半是暴露于媒体。

重新创建更复杂的三维微环境的相互作用是非常重要的,因为我们现在知道,细胞体内严重受到周围环境的影响,特别是由ECM。¹尤其是我们现在知道的微环境可以影响细胞对药物的反应。^2、3这突显出重要模拟体外药物测试的微环境。

开发3 d细胞模型的转变因此帮助创造更多的生理相关体外模型。这有两个主要目的:测试药物体外更有效率⁴或举个细胞植入的病人之前更好。⁵

而转向三维细胞培养已经在过去的十年中,它仍然是发展迅速,以满足日益增长和动态药品需求。今天,三维细胞培养依赖于大量的格式(通常)相结合,依靠水凝胶的使用,生物反应器,工程支架或微流体平台。⁶这里我们提供建议,我们认为任何人进行三维细胞培养的必要条件。

找出如何让你的细胞荧光

在2 d,亮视场成像通常足以想象你的细胞,在3 d事情变得更难解决细胞进化不止一个平面。让你的细胞荧光可以极大促进他们的三维可视化。也不是轻而易举的事情获得荧光细胞。你可以买荧光细胞系或转染它们自己如果你的实验室有专长。在这两种情况下,这些细胞就会稳定表达荧光记者的优势,从而永久地发出荧光。

如果你正在处理的主要细胞,要么是敏感或需要孤立的新鲜,反复使转染他们每次可能不理想。在这种情况下,考虑使用染料可以up-taken细胞使其暂时荧光(例如CellTracker通过表达载体)。然而这种方法只有在短时间内使荧光和细胞毒性。如果你使转染细胞,这是一个好主意荧光排序,这样你隔离了一个均匀的高荧光的细胞。否则,荧光在细胞的异质性将很难调整成像设置检测。

同时,仔细思考你想要的分析:有染色的方法为特定区域的细胞,例如,细胞核或整个细胞质膜或。整个细胞质染色可能不是最理想的,如果你要分析好突起或膜动力学。在任何情况下,记住,呈现细胞荧光可以影响他们的生理机能,所以它总是明智的比较相同的细胞荧光。

选择合适的成像平台的需求

有很多平台适合三维细胞培养,从传统的孔板,到生物反应器或微流体平台。选择正确的一个重要标准实验平台将是你的成像需求:如果你需要图片,特别是在高分辨率,你要确保你使用的平台提供了适当的成像深度。换句话说,这些细胞需要足够接近目标实现所需要的分辨率。这是相关的二维细胞培养实验,但是3 d细胞培养液中添加了一个额外的深度分析。因此,您需要确保在你的3 d细胞构造现在不太远的目标。

选择合适的配体的脚手架

体内,细胞与粘附网站互动蛋白质组成ECM(称为整合蛋白)大大影响了细胞的行为。¹不同器官是由不同的组合ECM的蛋白质,并且每个ECM蛋白质是由独特的整合蛋白组。决定使用哪一个ECM的试验(如胶原蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白或基底膜基质)一个很好的起点在于决定哪些器官你试图模仿:例如,并不是所有的器官都是特别丰富的胶原蛋白,如大脑。注意,你也可以用你自己通过添加聚合物配体网站,⁷或者可以创建一个混合混合天然和合成聚合物水凝胶。天然聚合物提供了合成高分子生物功能而提供可调的机械性能。⁸

控制支架的刚度和孔隙大小

您需要考虑的浓度和交联矩阵嵌入在你的细胞,这将影响其刚度和孔隙大小。刚度和孔隙大小会影响细胞迁移,以及生理学和药物反应。器官之间也各不相同;这些变量应该调整根据组织他们试图重现。一个重要问题在于这样一个事实,即刚度和孔隙大小变量不是互相独立的。通常,增加刚度增加聚合物的浓度;然而将最有可能减少你的水凝胶的孔隙大小。因此,很难独立隔离这些变量的影响,尽管一些组织已经成功地这样做了。^9、10

涂层支架的表面

细胞不喜欢所有的表面一样。虽然这对2 d细胞培养尤为重要,大多数细胞在直接接触表面,这也是相关的3 d细胞化验。3 d细胞化验可以包含细胞单层膜的一个更大、更复杂的组织如模型。例如,细胞已播种的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜模仿lung-air接口。¹¹或细胞一直在播种PDMS微流控通道重建一个圆柱形内皮单层覆盖3 d水凝胶。¹²在这些情况下,需要pre-coat这些表面与ECM如纤连蛋白促进细胞附着。另外,表面涂层也可以确保水凝胶附件¹³你的平台。

不要忘记扩散现在很重要!

在二维单层膜,你所有的细胞暴露于媒体:他们都是同样直接营养和氧气。在3 d事情改变。细胞嵌入到一个3 d支架必须依靠媒体的扩散通过支架。扩散距离成反比。这意味着细胞在不同深度的三维构造可以接触到不同的营养水平(不足)或氧,建立稳定或瞬态梯度。这例如是一个众所周知的现象在大肿瘤球状体,在坏死核心形式由于充足的氧气,营养和二氧化碳和废物清除能力。¹⁴这种类型的梯度存在于身体在选择过程中,因此可以有趣的体外繁殖。然而,一个人必须意识到这些梯度的建立在三维细胞培养他们并不总是想要造成一些细胞在支架不够营养。在体内,形成血管的组织允许细胞在血管附近保持营养和可行的。因此,除非你决定血管形成3 d细胞分析或设计其他策略来克服缺氧,¹⁵确保你控制你的深度构造和承认这些梯度的可能性,因为他们会影响细胞的生理学。

保持冷静,保持简单

最重要的是,尽量保持你的分析尽可能简单。在当前的比赛对实现最生理相关模型,人们很容易会添加许多细胞类型,或其他的变量,虽然它不直接解决你的生理问题。确保你尽可能回答许多初步的问题可以用最简单的分析,再转向更复杂的实验。

引用

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