如何区分人类干细胞的神经元

到目前为止,我们的大多数人类生物学的理解已经从啮齿动物外推。虽然这些系统是一种宝贵的资源了解体内生物学、人类和啮齿动物之间存在重要差异,模型,使我们能够理解人类的特定方面的分子和细胞生物学以及疾病一直缺乏。在过去的十年里,研究人员已经开发出方法使用人类多能干细胞(hPSCs)来生成特定的细胞类型,为探索人类生物学和疾病提供新的模型系统,以及提供新的药物筛选平台。多能干细胞具有分化成任何细胞类型的能力。通过推断从发育生物学,一系列专门的细胞类型现在可以生成的文化,包括生殖细胞、心肌细胞、内皮细胞和神经细胞。

人类的大脑含有数十亿的神经元,包括大量的细胞亚型产生复杂的电路和无数的专门功能。大脑皮层由最大的部分大脑,负责一系列关键功能,如认知、感知和决策。它集成了信号从大脑的其他部分,例如下丘脑,一个区域负责调节关键稳态过程,如喂养,睡觉和体温。

大脑皮层和丘脑下部都位于前脑皮质位于背侧,而下丘脑腹侧。因此,生成的关键这些大脑区域使用hPSCs体外操作规范的关键细胞通路的背侧和腹侧前脑。本指南的目的是分化的大纲协议hPSCs皮质神经元或下丘脑神经元,并为研究人员提供关键的指针是首次进行这些协议。为进一步阅读和更深入的协议,我们建议你看:(科文et al ., 2017;Merkle et al ., 2015;施et al ., 2012 b, 2012)。

维护的多能干细胞:一切的关键

最重要的参数的高效生成细胞类型从hPSCs是适当的维护你的hPSC文化。同时保持hPSCs小鼠胚胎成纤维细胞(喂)是金本位制,这种方法在技术上是麻烦。我们因此文化细胞feeder-free条件,在基质Geltrex mTeSR媒介。解冻hPSCs时,确保他们足够的密度,一般20000 - 30000细胞/厘米²一夜之间,文化在岩石抑制剂,以防止过度的细胞死亡。

不保持岩石中的细胞抑制剂超过24小时,因为这可以创建一个选择,可以使细胞系变得依赖于岩石抑制剂。

阻断细胞死亡也可以选择p53等有害致癌基因的突变。这些突变也可以积累,当细胞受到压力或人口瓶颈造成的过度或过于严格的使,可怜的孵化器维护(不是维持湿度或不正确校准温度和有限公司₂),或者不坚持一个严格的媒体改变常规。

媒体每天必须更换,确保媒体改变之前已达到室温。

不温暖的媒体在水浴,FGF2,一个细胞因子在mTeSR hPSC扩散的关键,将迅速降低在37˚C。

允许hPSCs扩大殖民地,密切关注细胞形态。未分化hPSCs很大(10 ~ 30μm),具有高核胞质比。通过hPSCs当殖民地成为接近合并或汇合的大约80%。不允许hPSCs成为over-confluent他们会自发地区别。

通过使用1毫米EDTA的细胞。当使,不要保持细胞的EDTA超过5分钟。确保你吸管轻轻当分离细胞,作为严格的移液会导致过度的细胞死亡。如果细胞不容易分离,在EDTA孵化了几分钟,监测超然的殖民地不断。通过的比率1:4-1:10取决于你开始密度,或在20000 - 30000细胞/厘米²如果使用一个细胞计数器。

确保你保持足够的冻结的股票hPSCs,通道数低(< 30段落)。还要注意,你不应该过分依赖某些hPSC线。几行更容易处理,使神经元更有效,这是值得尝试几行,找到最适合自己的。留意你hPSC线突然增长动力学的变化,这可能是一个迹象的突变或染色体异常。

准备神经细胞分化

扩大你的hPSCs以便你有足够多的细胞进行分化。我们通常使用10厘米的食物hPSCs神经分化。如果你想变得更少的细胞,你可以使用一个six-well盘子。当细胞达到80%汇合,看起来需要一个通道,它们可以被分离和镀分化。我们分离,分离成单个细胞悬液使用TryPLE,然而其他酶如Accutase也工作得很好。当细胞被分离、清洗和resuspended mTeSR媒体(包含岩石抑制剂),数一数,每厘米100000细胞密度板²盘子上涂有Geltrex或基底膜基质。第二天,细胞融合应该在70 - 80%,准备好开始分化。如果他们还没有达到这个密度,改变媒体(包含岩石mTeSR抑制剂)和离开细胞获得confluency额外的一天。

不开始分化,如果他们不像你会足够致密实现低效率。

皮质分化

当细胞开始分化,洗PBS的细胞,并添加皮质分化媒体:N2B27媒体包含TGFβ抑制剂SB431542(10μm)和LDN193189 (100 nM)和WNT抑制剂XAV939(2μm)。用20毫升10厘米菜six-well板或4毫升。对12天与皮质分化媒体,改变媒体每2天。

监视细胞和注意,他们应该在第二天达到融合。到了第四天他们应该成为围捕和统一的外观,与小明细胞核。天4 - 12细胞之间应该成为进一步压实,没有明显的核,最终可能会包含一些神经脊状折叠的细胞丛形成窄长高架结构。你可能会注意到其他的补丁的不规则形状的细胞紧凑排列。在一起,这些变化在细胞形态和外表的单层表明高效neuroectoderm形成。12天,使用TryPLE细胞应该分离成单个细胞,并通过1:3到Geltrex涂覆盘子,这样细胞仍使后100%汇合的。

重要的是要保持融合高阻止污染物的形成神经crest-derivatives可以大大超过神经祖细胞。

12到16天,文化之间的细胞N2B27 20毫克/毫升FGF2援助与扩散,和刚从D16 N2B27开始。大约16天你应该注意神经花结的形成,偏振环形结构包含大约30 - 100神经祖细胞。

如果细胞没有形成莲座状结构由20天,很可能分化不成功,建议你重新开始分化。

通过细胞的比例1:3再次20天,再次使用TryPLE /木瓜蛋白酶混合物,保持细胞在高融合与神经嵴避免污染。从20天,你会发现神经细胞的形成,往往花结的边缘。进行终端之间镀天-使用TryPLE /木瓜蛋白酶为所需的格式取决于您希望进行的实验。文化可以保持和过去的100天。

下丘脑分化

至于皮质神经元的生成,准备在第二节细胞,开始时下丘脑分化细胞融合大于70%。下丘脑的分化是由第一次诱导前脑neuroectodermal命运与皮质分化,然后将细胞ventralising声波Hedegehog信号受体激动剂。最后,神经发生是诱导NOTCH信号的抑制。留意关键形态学变化,发生在neuroectoderm形成(如皮质分化中描述)。关键的区别是,下丘脑祖细胞并不会形成神经花结,和他们的祖细胞形态越来越平坦。

在媒体N2B27分化进行的小分子如下:

• 0天:SB431542(10μm), LDN193189(100海里),XAV939(2μm)
• 第二天:SB431542(10μm), LDN193189(100海里),XAV939(2μm),凹陷(1μm) Purmorphamine(1μm)
• 第四天:SB431542(7.5μm), LDN193189(75海里),XAV939(1.5μm),射手座(1μm) Purmorphamine(1μm)
• 第六天:SB431542(5μm), LDN193189 (50 nM), XAV939(1μm)凹陷(1μm) Purmorphamine(1μm)
• 第八天:SB431542(2.5μm), LDN193189(25海里),XAV939(0.5μm),榫眼(5μm)
• 第十天:榫眼(5μm)
• 12天:榫眼(5μm)
• 14天,游离细胞使用TryPLE和replate Geltrex涂上菜肴的密度每厘米200000个细胞²。

改变媒体第二天N2B27 10 ng / mL BDNF和改变媒体每隔一天。

计划要进行的实验的细胞和细胞re-plate成你想要的格式(例如24-well板)在任何时候到35天。我们建议分离细胞使用TryPLE /木瓜蛋白酶和涂镀到Geltrex菜每厘米200000个细胞的密度²对于大多数的实验,但低密度成像例如100000细胞/厘米²。

质量控制

当re-plating D14板一些细胞3井的24-well板采用免疫染色。15天,4%甲醛溶液和修复的一些细胞进行染色的转录因子表达背前脑(皮层)或腹侧前脑(下丘脑)。皮质祖细胞应该表达FOXG1、OTX1/2 PAX6,应该主要是组织成莲座状结构。大多数下丘脑祖细胞应该表达NKX_2.1,除了一些伸展,OTP和SIM1表达式。

解决剩余的细胞在25 - 30天,染色神经元蛋白质。应该表达TBR1, CTIP2皮层神经元,以及pan-neuronal标记MAP2β3-Tubulin。旧皮质神经元(50 - 100天)应表达晚出生皮质转录因子SATB2 CUX1。下丘脑文化应该包含POMC表达细胞(约。5 - 10%的细胞)以及pan-neuronal标记MAP2β3-Tubulin。年长的下丘脑文化应该表达NPY, AGRP HCRT。

抗体和染色协议的详细信息,请参见(科文et al ., 2017;Merkle等)。

神经文化维护

细胞能够保持过去100天的文化与10 ng / mL BDNF N2B27。改变媒体每隔一天。监测媒体的颜色,确保它不会变得过于酸性(orangeyellow)。增加媒体卷在这种情况下保持粉红色(中性pH值)。改变媒体时要小心,确保媒体是在室温以上,留下少量的媒体井防止干燥,不要太大力吸管。

50天以后,文化成为容易分离。避免电镀密度很高(超过200000细胞/厘米²)来防止这种情况。

如果细胞似乎凝结或分离从井的边缘,每周添加10μg /毫升层粘连蛋白促进坚持塑料。我们建议增加细胞在塑料坚持玻璃相比要好。如果您希望执行成像、光学级塑料盘子可从Ibidi和其他供应商。我们避免种植细胞长时间在玻璃高度差。

引用

1. 这次P。侏罗山脉,M。,Merkle F.T. (2017)。生成和表征人类下丘脑神经元的功能。咕咕叫。Protoc。81年>,3.33.1-3.33.24。
2. Merkle, F.T.Maroof,。Wataya, T。Sasai, Y。,、L。Eggan, K。,自动跟踪代neuropeptidergic Schier下丘脑神经元从人类多能干细胞。
3. Merkle, F.T.Maroof,。Wataya, T。Sasai, Y。,、L。Eggan, K。Schier,自动跟踪(2015)。代neuropeptidergic下丘脑神经元从人类多能干细胞。发展142年,633 - 643。
4. 施,Y。科文,P。史密斯,J。罗宾逊,H.P.C.比赛中,F.J. (2012)。人类大脑皮层发展从多能干细胞功能兴奋性突触。Nat。> 15, 477 - 486。
5. 施,Y。科文,P。比赛中,F.J. (2012 b)。人类多能干细胞定向分化为大脑皮层神经元和神经网络。Nat Protoc。7, 1836 - 1846。