从小鼠脑组织中提取RNA的3个主要技巧

核糖核酸(RNA)是基因调控和表达所必需的。这就是为什么它的提取是基因表达分析的主要部分。在许多神经科学研究中，都使用了小鼠等动物模型。因此，你可能会发现你必须在某个时候从老鼠的脑组织中提取RNA。虽然提取过程本身并不复杂，但当试图从小鼠大脑样本中提取RNA时，会遇到两个挑战。第一个挑战是，与RNA合作比与DNA合作更困难，因为RNA由于其化学结构固有地不太稳定。它在较高温度(> 65°C)下不稳定，在金属离子存在或碱性条件下可降解。此外，在标准实验室条件下，rna酶比dna酶更普遍。即使是最轻微的RNase暴露也会影响RNA的稳定性。rna酶是有问题的，因为它们耐高温和化学处理。 The second challenge faced when extracting RNA from mouse brain is the nature of the tissue. In general, isolating intact total RNA is more difficult when processing certain problematic tissues, such as lipid and protein-rich tissues and fibrous tissues. The brain falls under this category due to its high lipid content. This guide outlines the main precautions you should take to overcome these challenges. It’s meant to supplement your main extraction lab manual. If you would like to read further on the topic, please check references 3 and 4.

实验室制备

在开始你的工作之前，你的实验室应该做好RNA工作的适当准备。如前所述，如果处理不当，RNA可能非常脆弱，而RNA酶是出了名的难以去除。在准备实验室时需要注意四个因素:pH值、温度、金属离子和rna酶。

1. 指定一个区域进行RNA提取:如果您在共享实验室工作，这将变得特别有用。实验室只有一个部分被指定用于RNA提取和处理，限制了RNA酶污染的来源。

2. 使用一次性免费塑料制品:塑料制品上的标签必须明确标明“不含rnase”。不要认为某些东西是无rnase的，因为它是无菌的，因为灭菌并不能去除rnase。此外，所使用的移液管尖端应包含一个过滤器，以防止任何污染。(注:如果要使用玻璃器皿，应在+180°C至+200°C下烘烤至少4小时。高压灭菌法无法去除rna酶。)

3. 用EDTA处理可重复使用的塑料制品:如果你打算使用可重复使用的塑料制品，必须在0.1 M NaOH/ 1mm EDTA(或含1% SDS的绝对乙醇)中浸泡(2小时，+37°C)，以去除任何金属离子。然后用depc处理过的水冲洗，加热到+100°C 15分钟。

4.收集你所有的实验设备:确保你将使用的所有设备都是可用的，并且易于使用。你可不想在拔牙的过程中手忙脚乱地拿着吸管。

5. 清洁实验室和设备:确保用100%乙醇或商用RNase灭活剂清洗RNA提取区域的所有工作台、移液器等。此外，保留所有用于RNA提取和分析的化学物质仅用于RNA应用。

6. 始终保持低温:所有RNA样品在使用时应保持在0 - 4°C。这就是为什么在收集样本或从存储中取出样本之前，确保手边总是有冰是很重要的。

样品收集和处理

1.始终穿着防护服:手套、白大褂和安全眼镜应该一直戴着。虽然这是标准的实验室程序，但在提取RNA时，为了保持样品的完整性和您的安全(特别是在使用有机提取时)，它变得更加关键。RNase污染的一个主要来源是人类皮肤，所以在提取的整个过程中一定要戴上手套。此外，不要触摸RNA提取区以外的任何东西，以防止RNase转移。

2. 样本收集:您应该确保快速收集样本，并通过快速冷冻、RNAlater或均质缓冲液对组织进行及时处理，以防止内源性rna酶的激活。

3.组织解剖:如果必须分离大脑的某些部分，如纹状体或海马体，则必须在无rnase的冷却表面上快速进行解剖。如果脑组织放置时间过长(>5分钟)或其温度升高，内源性RNase降解RNA的风险会增加。

4.均化:

• 在均质之前，确保你的均质机没有以前使用过的所有脂肪残留物。此外，确保其所有部件都不含rnase，根据其材料处理每个部件(参见实验室准备中的第2、3和5点)。
• 确保你的组织完全均匀化。均质缓冲液应该变得浑浊，没有可见的组织部分悬浮。
• 由于脑组织脂肪含量高，你必须采取额外的步骤从你的样本中去除脂肪物质。均匀化后，在4°C下以12000 x g离心10分钟。

在管的底部会形成含有细胞外物质、高分子量DNA和多糖的颗粒，而在上清液上方会聚集一层脂肪。丢弃脂肪层，收集上清液，按照提取试剂盒的指示继续提取。

5.储存:

• 组织:组织应在液氮中快速冷冻，并保持在-80°C。永远不要让脑组织解冻，即使是在提取的时候，因为这可能会导致RNA的降解。商用存储介质也可用。例如，脑组织可以储存在-20°C的RNAlater中。
• 提取的RNA: RNA应保存在-80°C。如果您希望长时间(数年)存储RNA，则应将其存储在-20°C或-80°C的乙醇等分液中。

故障排除

问题	可能的原因	采取的行动
低良率	不完整的均质化	使用少量的纸巾和肉末 确保它完全浸入其中 均匀化缓冲。
降解RNA	处理不当	因为降解的RNA不能被使用，你 还得再做一次手术。支付 特别注意温度和 任何RNase污染。
受污染的RNA	相分离不当	用脱氧核糖核酸酶处理去除残留 基因组DNA。 使用柱净化。

参考文献

1. 乔姆钦斯基，P. &萨基，N.(未注明)。硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取一步法分离RNA, 4。
2. 约翰逊，S. A.，摩根，D. G. &芬奇，C. E.(1986)。大鼠和人脑RNA的广泛死后稳定性。神经科学研究，16(1)，267-280。https://doi.org/10.1002/jnr.490160123
3. (2009)。RNA方法学:分离和鉴定实验室指南。学术出版社。
4. 尼尔森，H.(2011)。研究RNA。分子生物学方法(克里夫顿，新泽西州)，703,15 - 28。https://doi。org/10.1007/978 - 1 - 59745 - 248 - 9 - _2
5. trizol_reagent.pdf。(无日期)。从http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_ agent.pdf检索