细胞显微技术进展

我们都知道眼见为实。这使得科学家们早在1658年就用显微镜对细胞进行成像。¹从那时起，显微镜有了显著的现代化，并已成为细胞生物学实验室中普遍存在的工具，使用荧光和3D显微镜。

看到的越多就意味着相信的越多吗?随着细胞成像技术的最新进展，人们似乎正在朝着能看到更多东西的方向前进。数量似乎也可以与质量相结合:显微镜工具可以以更高的分辨率以惊人的精度获得更多的信息，更重要的是，在最小扰动的活细胞中。科学家现在可以常规地可视化单个细胞器，绘制染色体位点的运动，感知机械力，并以高通量的方式连续几天对细胞进行成像。继续阅读，了解细胞显微镜的五个关键进展，以了解该领域的发展方向!

1.布里渊显微镜

布里渊显微镜是一种非侵入性，无标签的方法，可以探测三维衍射有限分辨率的生物样品的粘弹性特性。²与原子力显微镜不同，它的优点是无接触。在病变组织中，细胞和组织的力学特性经常发生改变，因此对理解病理机制具有迫切的兴趣。布里渊光散射围绕着光与自发的、热诱导的密度波动的相互作用。机械性能，如刚度，可以从散射光谱的频移推断。²这使得许多类型的生物测量成为可能，例如整个细胞细胞内生物力学特性的3D映射，^3.或肠类器官的三维成像。²然而，这种显微镜技术仍然存在一些挑战需要解决，并且数据需要特别仔细的解释，因为一些人认为布里渊测量可能主要受水化作用而不是刚度影响。⁴

2.crispr标记的荧光成像

CRISPR无疑彻底改变了基因编辑和调控，在此过程中，它也促进了细胞显微镜技术的发展。研究小组用它来标记已定义的染色体位点，从而对活细胞基因组的3D结构进行成像，⁵与传统的原位杂交研究相反，它只能成像固定细胞。使用Cas9结合工程单导RNA (sgRNA)支架结合荧光蛋白组，Ma等人最近实现了在单个活细胞中同时成像多达6个染色体位点的技术，他们称之为CRISPRainbow。原则上，他们解释说，只要在CRISPRainbow上多添加一种颜色，就可以将同时检测基因组位点的活细胞数量增加到15个。⁶

3.薄片显微术

光片荧光显微镜(LSFM)只照亮样品的薄成像焦平面，并检测来自该特定平面的荧光，从而最大限度地减少失焦荧光和光漂白。⁷这意味着可以观察到生物体和细胞的动态，而不需要对样本进行切片。直到最近，分辨率还不允许在大到足以包含几个细胞的视场中进行亚细胞成像。的确，随着成像深度的增加，组织的光学异质性会引起像差，从而迅速降低分辨率、信号和对比度。贝塞尔光束和晶格光片已经取得了进展，但这种技术仍然复杂且昂贵。2019年，Chang等人描述了场合成的新方法，该方法有助于使用光学更简单的光片。⁸它将LSFM与自适应光学相结合，通过改变镜子的形状来补偿光学畸变，从而产生相等但相反的畸变。它需要更少的功率，最大限度地减少光漂白，并允许以高分辨率同时成像多种颜色。这使得Liu等人能够在纳米尺度上通过检测人类干细胞来源的类器官或斑马鱼背尾区域中网格蛋白包裹的凹坑的扩散来成像内吞作用随时间的变化。⁹它还帮助他们在斑马鱼胚胎发生过程中以精美的细节可视化细胞器动力学，以及神经元、癌症或免疫细胞在体内的三维细胞迁移。这一突破有望彻底改变定量亚细胞4D细胞生物学。

4.Holo-tomographic显微镜

全息层析显微镜(HTM)是一种定量相位显微镜方法，其中对象的复杂波场被编码成全息图，并与标本的旋转扫描相结合。⁹这导致快速三维重建活样品的折射率分布的分辨率低于衍射极限的光由瑞利准则定义。该技术的一个关键优点是它传递给样品的低能量，确保低光毒性，允许在不受干扰的情况下研究亚细胞动力学。现在已经开发出无散射系统，允许亚细胞高分辨率成像，例如单个线粒体经历融合和裂变周期。利用这种技术，Sandoz等人首次报道了在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中有丝分裂前细胞重组涉及的细胞器旋。在有丝分裂前80分钟，他们观察到细胞核、核仁、核膜、脂滴和线粒体旋转，这表明分裂前细胞物质重新分配的潜在机制有待进一步研究。¹⁰

5.高含量分析显微镜

看得更多不仅仅是为了达到高分辨率:它还意味着看得更久。科学家们意识到，对细胞进行短时间或离散时间点的成像可能意味着他们错过了关键的细胞动力学。这就是为什么现在正在开发可以对样品进行连续成像的系统。一方面，一些显微镜正在开发中，这样它们就可以集成在培养箱中，随着时间的推移，在2D中跟踪细胞的持续生长。类似地，一些培养箱已被设计成它们包含的摄像机可以对任何检测序列进行成像，以便能够在同一个培养箱中对多个样品进行成像。另一方面，为了设计数据丰富的实验，人们正在开发高通量系统，以便在孔板中对许多细胞分析进行长时间的研究。例如，Anastasov等人培养了大量由癌细胞和基质细胞组成的肿瘤球体，并对其进行了14天的成像，以量化它们在不同放疗和化疗组合下的生长情况。¹¹这种高含量的设置使他们能够筛选大量的化疗药物及其与辐射的组合，将长春碱确定为一种无线电增敏剂，与单独使用长春碱的试验相比，这种增敏剂在减小球体尺寸方面更有效。

引用:

1.豪伊杜SI。历史笔记:血细胞的发现。临床实验室科学。2003; 33(2): 237 - 238。

2.Prevedel R, Diz-Muñoz A, Ruocco G, Antonacci G.布里卢因显微镜-机械生物学的革命性工具?arXiv: 190102006(物理)。2019年1月7日在线发布。2021年6月18日访问。http://arxiv.org/abs/1901.02006

3.Antonacci G, de Turris V, Rosa A, Ruocco G.背景偏转布里渊显微镜显示ALS蛋白FUS改变细胞内应激颗粒的生物力学。Commun杂志。2018年,1(1):1 - 8。doi:10.1038 / s42003 - 018 - 0148 - x

4.吴鹏杰，Kabakova IV, Ruberti JW，等。水含量，而不是刚度，主导布里渊光谱测量水化材料。Nat方法。2018; 15(8): 561 - 562。doi:10.1038 / s41592 - 018 - 0076 - 1

5.陈斌，陈志强，陈志强，等。通过优化的CRISPR/Cas系统动态成像人类活细胞基因组位点。细胞。2013, 155(7): 1479 - 1491。doi:10.1016 / j.cell.2013.12.001

6.马华，涂立昌，李志强，等。利用CRISPRainbow对基因组位点进行dCas9和工程sgrna的多重标记。生物科技Nat》。2016年,34(5):528 - 530。doi:10.1038 / nbt.3526

7.Forero-Shelton M.在高分辨率下观察细胞变得更容易了。Nat方法。2019; 16(4): 293 - 294。doi:10.1038 / s41592 - 019 - 0373 - 3

8.张宝杰，张志刚，张志刚，张志刚，张志刚。基于光片合成的光片生成方法。Nat方法。2019; 16(3): 235 - 238。doi:10.1038 / s41592 - 019 - 0327 - 9

9.刘天龙，刘玉玲，王丽娟，等。观察细胞在其原生状态:成像亚细胞动力学在多细胞生物。科学。2018, 360(6386)。doi:10.1126 / science.aaq1392

10.山德士PA, Tremblay C, Equis S，等。通过折射率对活细胞中细胞器进行无标签3D分析，显示哺乳动物干细胞中有丝分裂前细胞器自旋。bioRxiv。2018年9月4日在线发布:407239doi:10.1101/407239

11.杨晓燕，Höfig I，等。同步化疗治疗的抗辐射肿瘤细胞的三维显微组织表型筛选。BMC癌症。2015; 15(1): 466。doi:10.1186 / s12885 - 015 - 1481 - 9