单细胞测序的应用

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发布日期:2021年4月28日

近年来，单细胞测序已成为一种广泛应用于不同生物研究领域的方法。为什么有这么多学术界和生物技术领域的研究人员如此迅速地采用了这种相对新颖的技术?单细胞测序或单细胞基因组学解决了大量组织测序方法的关键问题，使细胞分辨率分子读数无需纯化或富集特定的细胞类型。在广泛采用单细胞基因组学之前，RNA或DNA测序是通过从一块组织中分离和测序核酸来完成的。由于组织和器官由多种分子多样性的细胞类型组成，从细胞集合中获得关于RNA丰度或DNA序列变化的信息掩盖了细胞类型的真正异质性。这是回答基础科学和转化科学问题的一个关键挑战，因为我们越来越了解正常的身体功能和疾病过程在很大程度上依赖于特定细胞类型与确定的角色的协调相互作用。这些细胞类型特定的功能，在他们的顺序，利用不同的基因调控网络和基因表达谱在每个细胞类型。单细胞基因组学以不偏不倚的方式一次一个细胞地揭示这种分子多样性。

在本列表中，我们将讨论单细胞测序方法的类型、背后的技术，并将讨论如何将这些技术应用于生物医学科学各个领域的问题，从而产生新的生物学见解。

单细胞RNA测序

单细胞测序技术不断改进，已被用于分析单细胞的一系列分子特征。RNA测序是最早应用于组织或器官单细胞的技术之一。单细胞RNA测序(scRNA-seq)在微孔或微液滴中捕获单细胞，并利用逆转录(RT)和条形码RT DNA引物将每个细胞内的RNA分子转化为条形码互补DNA (cDNA)。逆转录之后是聚合酶链反应，以扩增得到的DNA，然后使用下一代测序对其进行测序。由于来自同一细胞的所有cDNA分子共享一个DNA条形码(也称为细胞条形码)，通过分析来自scRNA-seq实验的测序数据，可以在单个细胞的水平上估计每个RNA转录本的身份和丰度。一旦每个细胞中RNA转录物的丰度已知，这些RNA表达谱就可以通过对具有相似谱的细胞进行分组，以无偏倚的方式识别细胞类型。这种方法允许识别组织中所有细胞类型的基因表达谱。这些包括罕见的细胞类型或难以使用其他技术(如细胞分选)从组织中纯化的细胞类型。此外，使用RNA表达谱和关于细胞类型成员的信息，scRNA-seq可用于确定在特定条件下(如疾病)发生在每个单独的细胞类型中的基因表达变化。

scRNA-seq已成功应用于生物科学中的许多问题。其中最富有成效的是它在神经科学上的应用，因为哺乳动物大脑中有大量的细胞类型，而且使用传统技术净化和研究它们存在挑战。scRNA-seq已被用于在单细胞分辨率下创建发育中的人脑图谱，为理解正常的人类中枢神经系统如何发育以及神经发育疾病中特定细胞类型的分化和成熟如何受到干扰提供了强大的资源。

此外，scRNA-seq的一种变体，称为单核RNA测序(snRNA-seq)，最近使研究人员能够识别成熟人类和小鼠大脑中的细胞类型及其分子特征。snRNA-seq可以应用于死后脑组织或难以分离的细胞类型，如成熟神经元，通过测序来自单细胞核的RNA。¹了解成人大脑的细胞类型组成，进一步为开发针对影响大脑的疾病(如脑损伤和神经退行性疾病)的靶向细胞和药物疗法铺平了道路。

此外，snRNA-seq已被应用于直接研究人类大脑疾病，通过分析正常脑组织和受神经疾病影响的患者的脑组织。因此，对自闭症谱系障碍(ASD)的snRNA-seq研究发现，在这种疾病中，人类大脑皮层中特定的神经元亚型发生了巨大变化。²在另一项研究中，snRNA-seq被用于确定特定的神经元和胶质细胞类型在多发性硬化症病变中的反应和变化。 ^3.

用于表观遗传学分析的单细胞测序

表观遗传学是一个快速发展的领域，专注于研究通过改变染色质状态来控制基因表达的基因调控机制，染色质是DNA-蛋白质复合物，用于在细胞中包装DNA。染色质以两种主要状态存在:常染色质(也称为开放染色质)和异染色质。开放染色质区域的基因通常具有转录活性，而异染色质区域的基因则处于沉默状态。除了染色质状态外，基因表达由DNA的化学修饰直接调节，最常见的是通过胞嘧啶碱基的甲基化。围绕一个基因的DNA甲基化通常会导致基因沉默。表观遗传学领域的进展越来越多地表明，DNA甲基化和染色谱是高度组织和细胞类型特异性的。值得庆幸的是，单细胞基因组学的最新发展为科学家提供了分析单细胞表观遗传状态的方法，通过执行转座酶可达染色质单细胞测定，然后进行测序(scATAC-seq)，揭示开放染色质区域，以及单细胞DNA甲基化分析。

scATAC-seq已经被证明有助于理解各种组织中的特定细胞类型是如何发育的，以及这些发育程序是如何在疾病中失控的。这项技术已被用于了解干细胞、神经元和神经胶质细胞类型在人类大脑发育过程中的表观遗传特征⁴随着细胞的分化和成熟，老鼠的视网膜也会发生变化。⁵为了努力了解疾病的发病机制，scATAC-seq确定了记忆T细胞在1型糖尿病中维持的表观遗传程序，并介导自身免疫反应。⁶此外，scATAC-seq已被用于深入了解表观遗传调控在各种癌症(包括三阴性乳腺癌)发病机制中的作用⁷还有急性白血病。⁸

免疫学单细胞测序

适应性免疫系统依赖于T细胞和B细胞克隆产生T细胞受体(TCRs)和抗体的能力，这些受体和抗体可以与大量的抗原结合。这种令人难以置信的多样性是通过编码TCRs和抗体链的基因的随机重排和超突变形成的，然后选择T和B淋巴细胞，以消除体内对自我抗原有反应的细胞。这个过程产生一个估计的多样性10¹⁵－10^20.浏览TCRs及3×10¹¹为抗体。每个T或B细胞克隆都表达一种独特的TCR或抗体，一旦对外来抗原(如细菌、病毒或癌细胞)产生反应，这个克隆细胞就会经历大量的细胞分裂。由于TCR或抗体链的核苷酸序列可用于生产更多的T细胞和抗体用于治疗，甚至预测目标抗原，因此了解该序列在免疫学中是一个至关重要的挑战。由于TCR的克隆性质和抗体的多样性，单细胞方法最适合于了解发挥作用的机制。

最近，通过对COVID-19患者中产生SARS-CoV-2抗体的B细胞单克隆进行测序，单细胞B细胞分析被应用于识别对抗SARS-CoV-2的中和抗体。⁹这一令人鼓舞的新发现凸显了单细胞免疫谱分析的力量，它将成为发现传染性疾病治疗性抗体的主要驱动力。鉴于免疫系统在肿瘤发生和转移中的巨大重要性，单细胞免疫谱的另一个非常有前途的应用是癌症生物学。最近，这项技术也被用于了解肾细胞癌患者特异性TCRs的预后意义，以及肾细胞癌患者的T细胞异质性儿科肉瘤。旧金山州立大学(San Francisco State University)的助理教授Nicole Velmeshev认为，单细胞免疫分析在开发各种类型癌症的新疗法方面具有巨大的前景。Velmeshev博士说，鉴于抑制免疫反应是癌细胞逃避宿主防御的关键机制之一，并考虑到免疫疗法在许多类型的癌症中取得的巨大成功，了解确切的T细胞受体或抗体靶向癌细胞的能力至关重要。根据她的说法，一旦我们能够快速获得每个癌症患者和每个肿瘤的信息，我们将能够开发靶向治疗，例如嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞或抗体，它们能够高效地杀死特定个体的癌细胞。

多组学和单细胞测序的未来

最近，单细胞测序技术使研究人员能够从同一个单细胞中获得多个分子读数。例如，联合单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序可以同时确定单个细胞的转录和表观遗传谱。由于标记基因的RNA表达谱在确定细胞类型方面具有很高的信息量，这种组合RNA和开放染色质谱允许以无偏倚的方式鉴定特定细胞类型的表观遗传谱。此外，通过分析细胞类型内部和跨细胞类型的转录和开放染色质谱的变化，可以得出关于表观遗传调控在各种条件下(如疾病病理或细胞分化)对基因表达的影响的结论。

除了核酸，单细胞测序现在允许在单细胞水平上使用条形码抗体定量预先确定的一组蛋白质的丰度。由于蛋白质水平与细胞功能最相关，并且由于转录后调控的多个水平，并不总是与RNA表达完全一致，因此该读数有助于分析免疫细胞激活等快节奏细胞过程。由于单细胞蛋白质定量目前一次仅限于数十种蛋白质，这种方法与RNA表达的全基因组评估相结合。

参考文献

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