酶鸡尾酒为第二代生物燃料生产提供动力

巴西能源与材料研究中心(CNPEM)的研究人员通过基因工程改造了一种真菌，使其产生一种酶鸡尾酒，这种酶可以分解生物质中的碳水化合物，如甘蔗垃圾(顶部和叶子)和甘蔗渣，将其转化为可发酵的糖，以便在工业上高效地转化为生物燃料。

开发低成本的酶鸡尾酒是生产第二代乙醇的主要挑战之一。

第二代生物燃料由各种非食品生物质制成，包括农业残留物、木屑和废弃食用油。CNPEM研究小组的方法为优化利用甘蔗残渣生产生物燃料铺平了道路。

真菌木霉属reesei是植物细胞壁降解酶最多产的生产商之一，广泛应用于生物技术行业。为了提高其作为酶鸡尾酒生物工厂的生产力，研究人员在鲁特- c30(一种公开的真菌菌株)中引入了六种基因修饰。他们申请了专利，并在一份文章发表在杂志上生物燃料的生物技术．

“这种真菌被合理改造，以最大限度地生产这些具有生物技术价值的酶。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，我们修改了转录因子来调节与酶相关的基因的表达，删除了导致酶鸡尾酒稳定性问题的蛋白酶，并添加了真菌在自然界中缺乏的重要酶。因此，我们能够让真菌从农业工业废物中产生大量的酶，这是巴西廉价而丰富的原料，”CNPEM生物可再生能源实验室(LNBR)的科学主任Mario T. Murakami告诉Agência FAPESP。

根据巴西国家食品供应公司(CONAB)的数据，巴西每次收获的甘蔗约为6.33亿吨，每年产生7000万吨甘蔗垃圾(干质量)。这些废料在燃料乙醇生产中没有得到充分利用。

村上春树强调，实际上巴西用于分解生物质的所有酶都是从少数外国生产商进口的，这些生产商将该技术置于商业机密保护之下。在这种情况下，进口的混合酶可以占生物燃料生产成本的50%。

“在传统的模式下，需要数十年的研究才能开发出具有竞争力的酶鸡尾酒生产平台，”他说。“此外，鸡尾酒不能仅仅通过合成生物学技术从公开的菌株中获得，因为生产商使用了不同的方法来开发它们，比如适应性进化，将真菌暴露在化学试剂中，以及诱导基因组突变，以选择最有趣的表型。”然而，现在多亏了CRISPR/Cas9等先进的基因编辑工具，我们只用了两年半的时间就成功地建立了一个有竞争力的平台。”由CNPEM研究人员开发的生物工艺每升产生80克酶，是迄今为止报道的最高实验支持滴度t . reesei从低成本的糖基原料。这是之前科学文献中报道的真菌浓度(每升37克)的两倍多。

村上说:“这项研究的有趣之处在于，它并不局限于实验室。”“我们在半工业生产环境中测试了生物工艺，并将其扩大为试点工厂，以评估其经济可行性。”

他补充说，尽管该平台是为从甘蔗残渣中生产纤维素乙醇而定制的，但它可以分解其他种类的生物质，高级糖可以用于生产其他生物可再生能源，如塑料和中间化学品。

新型酶类

该工艺是LNBR为开发能够分解碳水化合物的酶而进行的广泛研究的实际结果(就工业应用而言)。在另一个研究由FAPESP支持，并在自然化学生物学，研究人员发现，真菌和细菌中主要存在七种新的酶类。

这种新酶属于糖苷水解酶(GH)家族。村上说，这些酶不仅在生物燃料领域有巨大的应用潜力，而且在医药、食品加工和纺织等领域也有巨大的应用潜力。这些酶将通过利用自然界分解多糖(由许多单糖组成的碳水化合物)的不同方式来激发新的工业过程。

这些酶可以分解β -葡聚糖，葡聚糖是谷物、细菌和真菌细胞壁中含量最丰富的多糖之一，也是世界上可用生物量的很大一部分，这表明这些酶在食品防腐剂和纺织品中的潜在用途。就生物燃料而言，关键的特性是它们能够消化富含植物纤维的物质。

村上说:“我们开始研究降解多糖的自然多样性，以及如何将这些知识应用于不同行业的过程。”“除了发现新的酶，这项研究的另一个重要方面是我们使用相似网络方法对这种酶家族产生系统和深刻的认识。这种方法使我们能够从零开始，在相对较短的时间内，得到迄今为止研究最多的β -1,3-葡聚糖活性酶家族，并提供有关特异性和作用机制的信息。”

对酶进行分类的主要标准通常是系统发育，即分子的进化史，而CNPEM的研究人员则关注功能。

“多亏了DNA测序技术的进步，我们现在有了许多已知的基因序列，并有了很好的能力来研究和描述分子和酶的功能。因此，我们已经能够改进相似网络方法，并首次使用它来研究多糖上活性的酶，”村上说。

利用相似网络方法，该小组根据功能将酶分为7个亚家族。通过描述每个亚家族的至少一个成员，研究人员系统地访问了降解酶家族中数千个成员中含有的β -葡聚糖的分子策略的多样性。

生化杰作

系统发育分析侧重于DNA中随着时间推移而保守的区域，而按功能分类则基于与功能分化相关的非保守区域。村上说:“这提高了我们的效率，使我们能够将1000多个序列分成7个具有相同功能的子组或类。”

由于这种方法是新颖的，研究人员进行了其他几项研究来重复检查和验证分类方法。从七组能够降解多糖的酶中，他们获得了24种全新的结构，包括各种底物-酶复合物，这些复合物被认为是帮助理解所涉及的作用机制的关键信息。

原创故事来自São保罗研究
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这项研究包括功能和结构分析，以了解这些酶如何作用于相关的碳水化合物。“多糖有几十种结构，并能形成多种化学键，”村上说。“我们想确切地观察每种酶能识别哪些化学键和结构。因此，它必须是一项多学科研究，结合结构和功能数据，并使用质谱、光谱学、诱变和衍射实验来阐明原子结构。”

参考文献

Fonseca等人(2020)。合理的工程木霉属reesei将RUT-C30菌株转化为工业相关的纤维素酶生产平台。生物燃料的生物技术．DOI:https://doi.org/10.1186/s13068-020-01732-w

Santos等人(2020)。糖苷水解酶家族对β-1,3-葡聚糖裂解的结构研究。自然化学生物学．DOI:https://doi.org/10.1038/s41589-020-0554-5

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