新程序在基因组编辑发现和量化意想不到的错误

莱斯大学实验室领导努力揭示潜在威胁疗法的疗效和安全性依据CRISPR-Cas9,诺贝尔奖获得者基因编辑技术,即使它似乎工作按计划进行。

生物工程师帮宝大米的乔治·r·布朗工程学院和他的团队发表的论文中指出科学的进步,虽然日常编辑DNA一直引起人们的关注,看不见的变化,伴随目标编辑还需要识别和量化。

宝指出2018年自然生物技术论文表示大缺失的存在。“当我们开始考虑我们能做什么来量化,由于CRISPR-Cas9设计的系统治疗镰状细胞病,”他说。

宝一直强烈要求CRISPR-Cas9作为一种工具来治疗镰状细胞病、追求,使他和他的同事们更紧密的治愈。现在研究人员担心大删除或其他未被发现的变化由于基因编辑可能坚持干细胞分裂和分化,从而对健康造成长期的影响。

“我们没有很好地理解为什么几千碱基的DNA Cas9削减现场可以失踪,DNA双链断裂仍然可以有效地重新加入,”宝说。“这是第一个问题,我们有一些假设。第二个是,生物的后果是什么?大缺失(像)可以到达附近的基因和破坏目标基因的表达和附近的基因。目前还不清楚如果摩门教的可能导致截短蛋白的表达。

“你也可能有错误折叠的蛋白质,与一个额外的域或蛋白质,因为大型插入,“他说。“各种各样的事情会发生,细胞死亡或功能不正常。”

他的实验室开发了一个程序使用单分子实时(SMRT)测序与双独特的分子标识符(UMI)找到并量化意想不到的摩门教的大型插入和当地的染色体重组,陪小插入/删除(INDELs) Cas9目标网站。

“量化大型基因修改,我们需要执行远程聚合酶链反应,但可能引起工件在DNA扩增,”宝说。“所以我们使用18 umi基地作为一种条形码。”

“我们将它们添加到我们想扩大识别特定的DNA分子DNA分子作为一种减少或消除工件由于远程PCR,”他说。“我们还开发了一种生物信息学分析管道SMRT测序数据和量化了摩门教和大型插入。”

宝实验室的工具,称为LongAmp-seq(长时间扩增子测序),准确地量化小INDELs和大像。与SMRT-seq不同,这就需要使用读音序器通常只提供核心设施,LongAmp-seq可以执行使用短内容音序器。

测试策略,实验室领导的研究小组大米女毕业生朱莉公园现在的助理研究教授生物工程,使用酿脓链球菌Cas9编辑β球蛋白(HBB), gamma-globin (HBG)和b细胞淋巴瘤/白血病11 (BCL11A)增强剂造血干细胞和祖细胞(公司)从镰状细胞病的患者,和PD-1基因在原发性t细胞。

他们发现大几千碱基的缺失发生在公司:高频HBB高达35.4%,14.3% HBG和15.2% BCL11A基因,以及PD-1(15.2%)基因t细胞。

以来的两个特定CRISPR指导rna包测试的实验室被用于临床试验治疗镰状细胞病,他说重要的是要确定大的生物影响基因修改由于Cas9-induced双链断裂。

宝说大米团队目前下游分析长期缺失的后果信使核糖核酸,中介代码为核糖体蛋白质。“然后我们将继续蛋白质水平,”宝说。“我们想知道如果这些大型删除和插入后持续gene-edited公司被移植到小鼠和病人。”

参考:公园SH、曹米、锅Y, et al。综合分析和准确量化意想不到的大CRISPR-Cas9基因引起的基因修改编辑。Sci睡觉。2022年。doi:10.1126 / sciadv.abo7676。

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