生产可靠的定量免疫印迹数据

在5月的分子生物技术问题,Bio-Rad实验室的研究人员,公司。报道的方法生产定量和可再生的免疫印迹数据能够建立可靠的定量技术的声誉。

西方墨点法执行已经实行了几十年,经常在实验室评估复杂样品中特定的目标蛋白质的存在。尽管科学界一直报道折叠蛋白表达的变化通过测量的密度差对西方写就的样本中靶蛋白带技术通常被认为是收益率只有半或nonquantitative数据的方法,试剂,仪器用于生成这些数据。这个缺点让作者进行本研究。

“在我访问实验室,研究人员一直问我如何更严格的方法免疫印迹定量,”肖恩·泰勒博士说,作者和Bio-Rad字段应用专家。“我们写这篇文章的演示应用程序简单的工作流再加上最新的试剂和仪器技术的使用可以确保生产可量化的结果从化学发光西方的屁股。”

准确的归一化加载差异是一个可以解决的挑战
在西方墨点法保证准确性,加载控件用于规范化的错误可以从蛋白质不精确的估计结果,吸量不准确,或不均匀蛋白转移。最常见的加载控制管家蛋白。然而,这些蛋白质通常样品中高度表达,经常超载凝胶巷靶蛋白丰度要低得多,从而减少其效用正常化。

在这些情况下,总蛋白规范化使用没有污点的技术可能是一个合适的选择。研究发现,使用没有污点成像量化蛋白质的总量密切匹配的每个车道结果确认数量,支持这种归一化方法的有效性。这个结果是在直接量化使用GAPDH的相对密度相比,一个共同的管家蛋白,没有很好地反映实际的数量由于信号饱和在高加载示例。

现代成像技术具有比电影更大的动态范围
研究还消除了普遍认为的电影应该是西方的屁股化学发光检测的首选方法。使用一个双重的稀释一系列蛋白质溶解产物,研究人员报道,CCD-based成像系统提供了一个线性动态范围近一个数量级大于电影(ng 0.04 - -2.5和0.04 - -0.31 ng)探测目标蛋白质。这允许精确量化的目标乐队相对密度之间的凝胶车道与成像系统与电影一样的屁股。

“本文演示了如何使用一个验证抗体成像系统以确保个人样品稀释和加载的定量线性动态范围内每个抗体产生优秀的光密度数据,”泰勒说。“它还表明,没有污点的技术是一个伟大的替代传统的管家蛋白正常化。”

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