超高速冷却使生命分子模式得以观察

荧光显微镜有独特的能力，观察细胞过程的规模，桥梁四个数量级。然而，它在活细胞上的应用从根本上受到分子的快速和不断运动的限制，这些分子定义了它的生活状态。更重要的是，光与荧光探针的相互作用，使分子过程的观察，导致他们本身的破坏。多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所系统细胞生物学部门开发的在显微镜下实时观察细胞的超快速冷冻冻结技术，现在绕过了这些基本问题。该方法的核心是将活细胞以每秒20万摄氏度的速度冷却到-196摄氏度。这使得前所未有的保存细胞生物分子在它们的自然安排在逮捕的时刻。在这种低温状态下，分子运动和光引起的破坏停止了，从而能够观察到在其他情况下看不见的生命分子模式。

我们身体的近100万亿个细胞是活的，因为它们通过持续的能量消耗来保持自己处于永久的活跃状态。因此，构成细胞的微观模式来源于数十亿纳米级生物分子的不断动态行为，如蛋白质、脂质、核酸和其他分子，它们以一种看似无序的方式忙碌着。为了观察更高规模的组织如何从这种不断的活动中出现，生物分子物种可以选择性地配备荧光探针。这些荧光分子是光子催化剂:它们吸收高能光子(例如蓝光)，随后发射低能量(红移)光子。这些光子可以通过显微镜成像，不仅可以精确定位标记的生物分子，还可以报告局部分子反应。然而，光对探针的破坏和非常重要的分子运动的模糊是阻碍观察生命分子过程如何在细胞尺度上产生结构的两个基本问题。

荧光显微镜的不确定原理

荧光显微镜对某种结构或分子的分辨程度，从根本上取决于能从这种结构中收集到的光的量。这类似于试图在夜空中看到星星。只有那些比周围环境明亮得多的恒星才能一眼看到。如果我们用较长的曝光时间拍摄夜空，会有更多的星星可见，但由于地球的自转，它们会变得模糊。同样，在荧光显微镜中，曝光时间可以延长，以增加检测到的光的量。然而，微观结构永远不会静止不动，而是表现出随机和定向运动。延长曝光时间会导致结构模糊。然而，在这种情况下，小结构的运动比荧光团的光子催化快得多，因此不能通过创建更好的探测器或更强的照明来提高精度。更重要的是，光子催化过程会产生有毒的自由基，不仅会破坏分子过程，最终杀死细胞，还会破坏荧光分子本身。这最终限制了可以从活细胞中的探针收集到的光的数量。

这个解决方案真的很酷

Philippe Bastiaens小组的Jan Huebinger现在开发了一种技术，可以在荧光显微镜下直接在毫秒内观察活细胞中任何时间点的动态时捕捉分子活动模式。通过这种方法，运动模糊和光破坏这两个基本问题可以同时被绕过。

通过极快地冷却到极低的温度(-196°C)，分子的运动几乎停止了。逮捕行动必须非常迅速，原因有二。首先，如果停止太慢，定义活细胞的充满能量的微观模式就会分解成死亡状态。其次，捕集的速度必须快于结冰的过程，因为结冰会破坏细胞。这也可以在更大的范围内观察到，例如，西红柿在冷冻后变得非常糊状。在0°C到-136°C之间的临界范围内，冰的形成速度非常快。然而，在很低的温度下(低于-136°C)，冰晶实际上不能再形成，因为水分子的运动实际上也停止了。这意味着，从字面上看，冷却速度必须高于每秒10万摄氏度。研究人员通过开发一种与显微镜集成的超快速冷却装置，在高压下将液氮(-196°C)的低温加速到钻石上，从而掌握了这一技术挑战。同一颗钻石还保存着反面含有细胞的样本。 The high pressure burst in combination with exceptional heat conductance of the diamond allowed to achieve the necessary high cooling rates to arrest cells at -196°C in their native configuration. This not only solved the problem of motional blur but also stop photochemical destruction. This opens up the possibility of virtually infinite exposure, highlighting molecular patterns that are otherwise obscured in the noise.

使无形可见

超高速冷冻冻结技术允许使用通常具有破坏性的高激光功率来分析几十纳米分辨率的原生分子模式，否则是看不见的。更重要的是，由于在-196°C没有光破坏，可以通过不同的显微镜模式观察到相同的被捕细胞，以测量从分子到细胞尺度的模式。因此，这项新技术发现了一种癌蛋白和一种肿瘤抑制蛋白的纳米级共组织，可以保护细胞不表现出恶性行为。“这是荧光显微镜的重要一步，特别是超分辨率显微镜和显微光谱的结合，可以在多个尺度上绘制细胞中的分子反应。它将改变我们观察细胞中分子组织和反应模式的方式，从而为生物物质的自组织能力提供更多的见解。”Philippe Bastiaens说。

参考:胡宾格J, Grecco H, Masip ME, Christmann J, Fuhr GR, Bastiaens PIH。在显微镜上对活细胞的超快冷冻冻结使不平衡分子模式的多尺度成像成为可能。Sci副词．7 (50): eabk0882。doi:10.1126 / sciadv.abk0882

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